고품질 플라스미드 추출의 비밀을 풀다

플라스미드 추출은 연구자에게 필수적입니다. 유전자 벡터로서 플라스미드는 품질이 중요한 백신 연구 및 유전자 치료에 필수적입니다. 주요 품질 요인에는 초나선 비율과 엔도톡신 함량이 있습니다. 규정은 다양합니다. FDA ≥80%, SMPA ≥85%, NMPA ≥90%, <5% 선형/개방형 원형 DNA. 고객은 종종 ≥95% 초나선을 선호합니다. 엔도톡신 수준은 다음과 같습니다. 연구(>50 EU/µg), 형질감염(<50 EU/µg), 엔도톡신 없음(<0.1 EU/µg).

초나선 플라스미드 DNA

Escherichia coli의 플라스미드에는 초나선형(SC), 개방형 원형(OC), 선형(L) DNA가 포함됩니다. 높은 SC 비율은 형질감염 효율과 발현을 증가시킵니다. 예를 들어, 85.45% SC 플라스미드의 형질감염은 2.5배 더 높고, 93.28% SC 플라스미드의 HGF 발현은 1.8배 더 높아 SC DNA의 우수성을 확인합니다.

열린 원형 DNA: 이중 가닥 DNA의 한 가닥이 끊어지면 초나선 구조가 느슨해져 전기영동 중 가장 느리게 이동하고 맨 위에 위치하는 더 큰 부피의 열린 원형 플라스미드를 형성합니다.

선형 DNA: 플라스미드 DNA의 두 가닥이 모두 끊어지면 선형 구조가 형성되며, 이는 개방형 원형 DNA보다 빠르게 이동하지만 초나선 DNA보다 느리게 이동하며 두 번째로 위치합니다.

초나선형 DNA: 두 개의 나선이 서로 얽혀서 DNA 나선을 기반으로 초나선형 구조로 꼬여 있습니다. 가장 작은 부피를 가지고 있으며 전기영동 중에 가장 빠르게 이동하며, 바닥에 위치합니다.

초나선 비율의 정량 분석

실험실에서는 아가로스 겔 전기영동(AGE)과 Gel-Pro Analyzer를 사용하여 전기영동 이미지를 통해 초나선 비율을 판단합니다. 한 이미지는 97.539% SC DNA를 보여주고, 다른 이미지는 63.833% SC와 36.167% OC DNA(선형 DNA는 보이지 않음)를 보여줍니다.

플라스미드 내 엔도톡신의 비밀

엔도톡신은 그람 음성 세균의 세포벽 외층의 구성 요소로, 세균이 죽거나 용해된 후 방출되며 독성 리포폴리사카라이드 A를 함유하고 있습니다. 플라스미드 추출 중에 엔도톡신이 용해 용액으로 들어가 형질감염 효율에 영향을 미치고 비특이적 면역 반응을 유발하여 실험에서 거짓 양성 결과를 초래합니다.

엔도톡신의 정량 및 정성 분석

Limulus amebocyte lysate(LAL) 검사는 lipopolysaccharide(LPS)에서 2-keto-3-deoxyoctonic acid(KDO)와의 응집을 통해 엔도톡신을 검출합니다. 이는 정성적이고 반정량적이며, 샘플과 혼합할 때 응고 또는 색상 변화를 통해 엔도톡신 존재를 나타냅니다.

Yaohai Bio-Pharma는 엔도톡신이 없는 초나선 플라스미드를 제공합니다. Yaohai에 아웃소싱하면 형질감염 및 발현 효율이 향상됩니다. 제공된 플라스미드는 SC 비율이 ≥95%(평균 85%±10%)이고 엔도톡신 수치는 ≤0.1, ≤0.01 또는 ≤0.005 EU/μg입니다.

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