고품질 플라스미드 추출의 비밀 해독하기

플라스미드 추출은 연구원들에게 매우 중요합니다. 유전자 벡터로서, 플라스미드는 백신 연구와 유전자 요법에서 품질이 중요한 역할을 합니다. 주요 품질 요소에는 초안선 비율과 내독소 함량이 포함됩니다. 규제는 다양합니다: FDA ≥80%, SMPA ≥85%, NMPA ≥90%, 그리고 <5% 선형/개방 순환형 DNA입니다. 고객들은 종종 ≥95% 초안선을 선호합니다. 내독소 수준은 다음과 같습니다: 연구 (>50 EU/µg), 전달 (<50 EU/µg), 그리고 내독소 무료 (<0.1 EU/µg).

초안선형 플라스미드 DNA

에셔히아 콜라이에서 얻은 플라스미드에는 초안선형(SC), 개방 순환형(OC), 그리고 선형(L) DNA가 포함됩니다. 높은 SC 비율은 전달 효율과 발현을 증대시킵니다. 예를 들어, 85.45% SC 플라스미드의 전달 효율은 2.5배 더 높고, 93.28% SC 플라스미드의 HGF 발현은 1.8배 더 높아 SC DNA의 우수성을 입증합니다.

개방형 원형 DNA: 이중 사슬 DNA의 한쪽 사슬이 단절될 때 초구조가 느슨해져 부피가 더 커지고 전기영동 중 가장 천천히 이동하며 상단에 위치합니다.

선형 DNA: 플라스미드 DNA의 두 사슬 모두가 단절되면 선형 구조가 형성되며, 비교적 작은 부피로 개방형 원형 DNA보다는 빠르게 이동하지만 초구조 DNA보다는 느리게 이동하며 두 번째 위치에 있습니다.

초구조 DNA: 두 헬릭스가 얽혀 DNA 헬릭스를 기반으로 초구조가 형성됩니다. 가장 작은 부피를 가지고 있으며 전기영동 중 가장 빠르게 이동하며 하단에 위치합니다.

초구조 비율의 정량적 분석

연구실에서는 아가로스 겔 전기영동 (AGE)과 Gel-Pro Analyzer를 사용하여 전기영동 영상에서 초구조 비율을 판단합니다. 하나의 영상은 97.539% SC DNA를 보여주고 다른 하나는 63.833% SC와 36.167% OC DNA를 보여주며 (선형 DNA는 보이지 않음).

플라스미드 내 독소의 비밀

엔도톡신은 그람 음성 세균의 세포벽 외층의 구성 요소로, 세균이 사멸하거나 용해된 후 방출되며, 독성 있는 리포폴리사카라이드 A를 포함하고 있습니다. 플라스미드 추출 과정에서 엔도톡신이 용해액에 들어가 전달 효율에 영향을 미치고 비특이적인 면역 반응을 유발하여 실험에서 허위 양성을 초래할 수 있습니다.

엔도톡신의 정량적 및 정성적 분석

리무러스 암초세포 용해물(LAL) 시험은 리포폴리사카라이드(LPS) 내 2-케토-3-데옥시옥톤산(KDO)과 응집작용을 통해 엔도톡신을 감지합니다. 이 방법은 정성적이고 준정량적이며, 샘플과 혼합했을 때 응고나 색상 변화를 통해 엔도톡신 존재 여부를 나타냅니다.

야오하이 바이오-파마는 무엔도톡신 슈퍼코일 플라스미드를 제공합니다. 야오하이에게 아웃소싱하면 전달 및 발현 효율이 향상됩니다. 제공되는 플라스미드는 ≥95%의 SC 비율(평균 85%±10%)을 가지며, 엔도톡신 레벨은 ≤0.1, ≤0.01 또는 ≤0.005 EU/μg입니다.

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