IVT 메신저 RNA 준비

체외 전사(In vitro transcription, IVT)는 실험실 규모로 마이크로그램에서 밀리그램에 이르는 양의 mRNA를 생산할 수 있는 선호되는 방법입니다. 연구 목적으로 재-Agent 공급업체들은 중간 길이(1000-4000 염기)의 mRNA에 적합한 다양한 IVT 반응 시스템을 개발했습니다.

본 문서에서는 실험실 규모에서 사용되는 전통적인 IVT 반응 시스템과 초장쇄 mRNA(>9000 염기)에 적합한 IVT 반응 시스템을 포함하여 mRNA의 체외 전사를 요약하겠습니다.

Kit은 CleanCap AG와 함께 전사 동시 캡핑을 가능하게 하고 m1ψ를 통해 면역원성을 줄일 수 있습니다. DNase I는 잔류 DNA를 제거합니다. 낮은 수율은 혼합 부족, 재-Agent 산화 또는 DNA 템플릿 문제로 인해 발생할 수 있으며, 이는 냉동 이심분리, 신선한 재-Agent, 대조 실험 및 템플릿 양/반응 시간 조정을 통해 완화될 수 있습니다.

Yaohai Bio-Pharma는 다양한 사전 제조된 IVT RNA 제품(액체/동결 건조 분말)과 LNP 완제품을 제공하며, 형광 단백질(eGFP, mCHERRY), 루시페라제, 재조합 효소 Cre 및 항원 OVA와 같은 단백질들을 인코딩하여 다양한 실험 또는 프로젝트 요구를 충족시킵니다.

초장 mRNA용 IVT 시스템

과도하게 긴 mRNA(>9000 nt)의 경우 전통적인 IVT가 작동하지 않을 수 있습니다. IVT 구성 요소에 대한 심층적 이해와 합리적인 조정이 필요합니다.

DNA 템플릿: 대응하는 프로모터 서열을 가진 선형화된 플라스미드나 PCR 제품으로, RNase-free H2O에 녹여야 합니다. 최적의 IVT 조건을 위해 40 nM보다 높은 DNA 템플릿 농도가 권장됩니다.

DTT: 전사 중 효소 활성을 유지합니다. 최적의 효소 활성을 위해 반응 버퍼에 신선한 DTT를 추가해야 합니다.

RNase 억제제: RNase 활성을 억제하고 mRNA 안정성을 유지합니다.

T7 RNA 폴리머라제: 프로모터 서열에 해당하는 DNA를 RNA로 전사시킵니다. T7 RNA 폴리머라제의 활성은 pH와 마그네슘 이온에 영향을 받습니다.

마그네슘 이온 (Mg2+): RNA 폴리머라제의 보조인자입니다. 너무 낮은 농도는 전사 효율을 감소시키고, 너무 높은 농도는 RNA 분해를 유발합니다. 자유 [Mg2+]는 핵산 농도에 따라 조정되어야 합니다. 각 핵산은 하나의 [Mg2+]를 결합하므로, [Mg2+] 농도는 총 핵산 농도보다 높아야 합니다.

뉴클레오타이드 삼인산 (NTP): 기질로서 NTPs는 RNA의 기본 단위입니다. 7 mM 이상의 NTP 농도는 mRNA 생산에 긍정적인 영향을 미칩니다.

스페르미딘: DNA-효소 복합체를 안정화하고 전사 반응을 촉진하지만, 과도한 농도는 억제 효과를 나타냅니다. 권장 스페르미딘 농도는 1~3 mM 사이입니다.

무기 피로인산 효소 (PPase): 무기 피로포스페이트 이온(PPi)의 축적을 방지하기 위해 IVT 반응에 추가되며, 이를 통해 Mg2+와의 결합을 막고 충분한 자유 상태의 Mg2+를 유지합니다.

선도적인 기술과 IVT mRNA 경험을 바탕으로, 야오하이 바이오-파마는 시퀀스 설계, IVT RNA 준비(m1ψ 변형 포함), RNA 순환화, 정제, 동결 건조, LNP 캡슐화 및 품질 검사까지 한 번에 제공하는 IVT RNA 서비스를 제공합니다.

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