Το Yaohai Bio-Pharma ετοιμάζει circRNA με βάση το σύστημα PIE (σύμφωνα με την ομαλοποίηση εξόν και ιντρόν), το οποίο βασίζεται στην αυτοσπλάισιν λειτουργία των ιντρόν τύπου I για να επιτύχει την κυκλικοποίηση του RNA. Το σύνολο PIE σχεδιάζεται χρησιμοποιώντας το γονίδιο T4 td ή το προηγούμενο γονίδιο tRNA ψάρια, και η διάταξη είναι η εξής:
Το ιντρόν RNA και το υποστηρικτικό τμήμα εξόν διαιρείται σε δύο μέρη (5' τερματικό και 3' τερματικό), όπου το τερματικό τμήμα 5' μεταφέρεται στο άκρο της στόχου ακολουθίας, το τερματικό τμήμα 3' εισάγεται στην πρώτη θέση της στόχου ακολουθίας, και η ακολουθία στόχου γενών εισάγεται στο μεσαίο.
Υπό την καταλύση του GTP, η δομή PIE οδηγεί στην κυκλικοποίηση ακολουθιών εκτός από τα introns. Συνδυάζοντας μια λογική στρατηγική επιτάχυνσης της ταχύτητας κυκλικοποίησης, το Yaohai Bio-Pharma μπορεί να επιτύχει κυκλικοποίηση ακολουθιών μέχρι και 4 kb με ταχύτητα κυκλικοποίησης πάνω από 80%.
Σχήμα 1. In vitro κυκλικοποίηση circRNA με βάση το σύστημα PIE
Διαδικασία | Επιλογές Υπηρεσίες | Λεπτομέρειες Υπηρεσίας | Περίοδος Παράδοσης (εργασιακή μέρα) |
σχεδιασμός και βελτιστοποίηση ακολουθίας circRNA | Σχεδιασμός και βελτίωση κωδικοποιημένων ακολουθιών |
.Alignments ακολουθίας CDS Βελτιωμένη κωδικοποίηση CDS |
1 |
Σχεδιασμός και βελτιωτική ανάπτυξη μη κωδικών ακολουθιών |
Σχεδιασμός και βελτιστοποίηση ακολουθιών intron και exon Σχεδιασμός και βελτιωτική ανάπτυξη ακολουθίας ομογενούς χεριού Σχεδιασμός και βελτιωτική ανάπτυξη ακολουθίας διαστηματικού |
1-2 |
Συστατικά CircRNA | Βιολογικές Λειτουργίες | Στρατηγικές Βελτιωτικών Μέτρων | |
Διτερματικές ακολουθίες intron και exon | Αυτοσπαράτωση intron κατά GTP για την κυκλικοποίηση των ακολουθιών εκτός του intron. | Σχεδιάστηκε σύμφωνα με το γονίδιο T4 td ή το προγονίδιο tRNA ψηλίδας. | |
Κωδικοποίηση | IRES | Εσωτερική θέση αναγνώρισης ριβοσωμάτων που διέπει τη μετάφραση του circRNA. | Διαγραφή ακολουθιών εσωτερικού εισόδου ριβοσωμάτων (IRES) από διαφορετικές ιοσωματικές πηγές, για παράδειγμα EMCV, CVB3 πηγές. |
CDS | Περιοχές κωδικοποίησης πρωτεΐνων, ακολουθίες που κωδικοποιούν αντιγόνα, αντισώματα ή άλλες λειτουργικές πρωτεΐνες. | Η κωδικοποίηση κωδώνα αυξάνει το επίπεδο μετάφρασης· ορισμένοι μη βελτιστοποιημένοι κωδώνες μπορεί να έχουν ρόλο στην καταπλύσιμη των πρωτεΐνων. | |
Μη κωδικοποιούμενες | Μη κωδικοποιούμενες ακολουθίες | Στόχοι miRNAs ή πρωτεΐνων για να επιβάλλουν ρύθμιση γονιδίων ή πρωτεΐνων. | Στόχοι συγκεκριμένων σημείων δεσμεύσεως για miRNAs ή πρωτεΐνες μπορούν να επαναλαμβάνουν τις ακολουθίες του σημείου δεσμεύσεως. |
Η Yaohai Bio-Pharma εισήγαγε το έλεγχο προϊόντος ενισχυμένου πράσινου φθοριστικού πρωτεΐνου (eGFP) circRNA, το οποίο βασίζεται στο σύστημα PIE για να επιτευχθεί η κυκλοποίηση του RNA.
Χρησιμοποιώντας συνηθισμένο φάρμακο παράγωγης, το eGFP circRNA εισάγεται στα κύτταρα 293T, και μετά από 24 ώρες μπορεί να ανιχνευθεί η φθοριστική σήμαση eGFP (πράσινη), η οποία θα ενισχυθεί μετά από 48 ώρες. Η φθοριστική σήμαση μπορεί ακόμη να ανιχνευθεί στις 7η και 14η μέρες μετά την εισαγωγή.
Επαλήθευση έξω από το οργανισμό της έκφρασης eGFP circRNA