Характеристика мРНК 3' poly(A).
Характеристика мРНК 3' poly(A).
3' полі(А) хвіст (поліаденозин) мРНК є невід’ємною частиною посттранскрипційної регуляції, впливаючи на експорт, стабільність і трансляцію мРНК. У випадку мРНК, транскрибованих in vitro (IVT), хвіст полі(А) вводиться або під час спільної транскрипції матричним способом, або через ферментативний процес хвоста нематричним способом. Цей 3′-полі(A) служить критичним атрибутом якості (CQA) для IVT РНК, що вимагає ретельної характеристики як під час розробки процесу, так і під час випуску партії.
Yaohai Bio-Pharma надає спеціалізовані послуги з визначення характеристик 3'-полі(А) із застосуванням таких методів, як розщеплення рибонуклеазою Т1 (РНКаза Т1), високоефективна рідинна хроматографія з оберненою фазою (IP-RP-HPLC)/рідинна хроматографія-мас-спектрометрія. (LC-MS), і комплексний аналіз даних.
Нормативні вимоги до характеристики мРНК 3' poly(A).
Відповідно до нормативних міркувань ВООЗ, «цілісність структури мРНК вважається критично важливим атрибутом якості для вивільнення мРНК. Таким чином, необхідний контроль цілісності мРНК, ефективності 5'-закриття, наявності або довжини 3' полі(А) хвоста і так далі».
Аналітичний метод
аналіз |
Методи |
Характеристика мРНК 3' poly(A). |
LC-MS після травлення |
Процедура
Крок 1. Розщеплення РНКазою Т1
Прямий аналіз повнорозмірної інтактної мРНК за допомогою РХ-МС є недоцільним через її розмір і неоднорідність. Щоб дослідити полі(А) хвіст, його необхідно відщепити від повнорозмірної мРНК. Поширений метод включає ферментативне розщеплення РНКазою T1, вибірково розщеплюючи 3'-кінець rG, зберігаючи послідовність полі(А). Зразок мРНК піддається розщепленню за допомогою РНКази T1, і фрагменти розщеплення, що містять розтягнення полі(А), виділяють за допомогою магнітних кульок, покритих оліго dT.
Крок 2. IP-RP-HPLC/LC-MS
Витягнуті хвости пройшли аналіз за допомогою РХ-МС, пропонуючи точну інформацію про довжину хвоста з роздільною здатністю одного нуклеотиду. У олігонуклеотидному аналізі LC-MS кращим хроматографічним режимом є розділення обернено-фазових іонних пар (IP-RP) з добавками рухомої фази амінів завдяки їх надійній роздільній здатності та сумісності з мас-спектрометрією (MS).
Крок 3. Аналіз даних
Довжина полі(А) хвоста та його відносна кількість залежать від кількості та інтенсивності піків, поділеної на масу аденозину. Після обробки або деконволюції масового спектру розпізнається очікувана маса 100-мерного хвоста полі(А) (33,163 329 Да в коробці), що супроводжується серією мас, розділених на XNUMX а.е.м., що еквівалентно масі аденозину (А) .
Випадок 3' полі(А) Характеристика за допомогою РХ–МС
Компанія Yaohai-BioPharma розробила надійний метод визначення характеристик мРНК 3' poly(A), включаючи розщеплення РНКазою T1 та IP-RP-HPLC/LC-MS.
Компанія Yaohai-BioPharma розробила надійний метод визначення характеристик мРНК 3' poly(A), включаючи розщеплення РНКазою T1 та IP-RP-HPLC/LC-MS.
EN
