Ефективність блокування мРНК 5'
Значення аналізу ефективності кепування мРНК 5'
Кеп-структура, розташована на 5'-кінці мРНК, відіграє ключову роль в ефективній трансляції, стабілізації та транспортуванні мРНК в еукаріотах. У контексті мРНК, що транскрибується in vitro (IVT), 5'-кеп вводиться за допомогою ко-транскрипційного кепування або ферментативного кепування. Будучи незамінним компонентом IVT РНК, 5'-ковпачок виступає як критичний атрибут якості (CQA), що вимагає комплексної характеристики протягом розробки процесу та випуску партії.
Yaohai-Bio Pharma надає комплексні рішення для аналізу ефективності 5'-кепінгу, включаючи конструкцію олігонуклеотидних шин (зондів), розщеплення РНКази H, високоефективну рідинну хроматографію з оберненою фазою IP-RP (IP-RP-HPLC)/рідинну хроматографію. -мас-спектрометрія (LC-MS), аналіз даних.
Нормативні вимоги до цілісності мРНК
Відповідно до нормативних міркувань ВООЗ, «цілісність структури мРНК вважається критично важливим атрибутом якості для вивільнення мРНК. Таким чином, необхідний контроль цілісності мРНК, ефективності 5'-закриття, наявності або довжини 3' полі(А) хвоста і так далі».
Аналітичний метод
Аналіз |
Методи |
Ефективність блокування мРНК 5' |
LC-MS після травлення |
Процедура
Крок 1. Конструкція олігонуклеотидних шин (зонда).
Зонд розщеплення, що включає 2'-O-метилнуклеотиди та тетрадезоксирибонуклеотиди, служить для розщеплення комплементарного ланцюга РНК у певних положеннях, коли присутня РНКаза H. Цей метод виявляється дуже цінним для цілеспрямованої генерації більших фрагментів РНК.
Етап 2. Розщеплення РНКазою H
Біотинільований зонд, стратегічно розроблений як комплементарний до 5'-кінця мРНК, застосовується в поєднанні з РНКазою H для каталізації цільового розщеплення 5'-кінцевого олігонуклеотиду, що має кеп-структуру.
Крок 3. IP-RP-HPLC/LC-MS
У олігонуклеотидному РХ-МС-аналізі кращим хроматографічним режимом є поділ із зворотною фазою за допомогою іонних пар (IP-RP) з використанням добавок мобільної фази амінів. Це пояснюється їхньою чудовою роздільною здатністю та сумісністю з мас-спектрометрією (МС).
Крок 4. Аналіз даних
Виразні маси, що спостерігаються у фрагментах розщеплення, що містять кепку m7GpppG, на відміну від тих, що мають дифосфатну, трифосфатну або неметильовану G-кепку (GpppG), полегшують їх ідентифікацію та дозволяють оцінити ефективність кеппування.
Випадок аналізу ефективності обмеження за допомогою LC–MS
Компанія Yaohai-Bio Pharma розробила надійні методи аналізу ефективності блокування мРНК, починаючи від дизайну олігонуклеотидних шин (зондів), розщеплення РНКазою H, IP-RP-HPLC/LC-MS до аналізу даних.
Загальні іонні хроматограми (ліворуч) і електророзпилюваний мас-спектр (праворуч) фрагментів розщеплення 5'-кінців
EN
