mRNA 3' poli(A) Karakterizasyonu
mRNA 3' poli(A) Karakterizasyonu
MRNA'nın 3' poli(A) kuyruğu (poliadenosinler), mRNA ihracatını, stabilitesini ve translasyonunu etkileyen, transkripsiyon sonrası düzenlemenin ayrılmaz bir parçasıdır. İn vitro kopyalanmış (IVT) mRNA'lar durumunda, poli(A) kuyruğu ya şablonlu bir şekilde birlikte transkripsiyon sırasında ya da şablonsuz bir şekilde bir enzimatik kuyruklama işlemi yoluyla eklenir. Bu 3′ poli(A), IVT RNA'ları için kritik bir kalite özelliği (CQA) görevi görür ve hem süreç geliştirme hem de toplu sürüm sırasında kapsamlı karakterizasyon gerektirir.
Yaohai Bio-Pharma, ribonükleaz T3 (RNase T1) bölünmesi, İyon çifti ters fazlı yüksek performanslı sıvı kromatografisi (IP-RP-HPLC)/sıvı kromatografisi-kütle spektrometrisi gibi teknikleri kullanarak uzmanlaşmış 1' poli(A) karakterizasyon hizmetleri sağlar. (LC-MS) ve kapsamlı veri analizi.
mRNA 3' poli(A) Karakterizasyonu için Düzenleyici Gereksinimler
Dünya Sağlık Örgütü'nün düzenleyici hususlarına göre, "mRNA'nın yapısının bütünlüğü, mRNA'nın salınması için kritik bir kalite özelliği olarak kabul edilir. Bu nedenle mRNA bütünlüğü, 5' kapatma verimliliği, 3' poli(A) kuyruk varlığı veya uzunluğu vb. için kontrol gereklidir."
Analitik metod
Analiz |
Yöntemler |
mRNA 3' poli(A) karakterizasyonu |
LSindirimden sonra C-MS |
Prosedür
Adım 1. RNase T1 bölünmesi
Tam uzunlukta bozulmamış mRNA'nın LC-MS ile doğrudan analizi, boyutu ve heterojenliği nedeniyle pratik değildir. Poli(A) kuyruğunu incelemek için tam uzunluktaki mRNA'dan ayrılması gerekir. Yaygın yöntem, poli(A) dizisini korurken rG'nin 1' ucunu seçici olarak bölen RNase T3 ile enzimatik sindirimi içerir. MRNA örneği, RNaz T1 ile sindirime tabi tutulur ve poli(A) uzantıları içeren bölünme parçaları, oligo dT kaplı manyetik boncuklar kullanılarak izole edilir.
Adım 2. IP-RP-HPLC/LC-MS
Çıkarılan kuyruklar, tek nükleotid çözünürlüğünde kesin kuyruk uzunluğu bilgisi sunan LC-MS kullanılarak analize tabi tutuldu. Oligonükleotid LC-MS analizinde, amin mobil faz katkı maddeleri ile iyon eşleştirmeli ters faz (IP-RP) ayırmaları, sağlam çözme güçleri ve kütle spektrometresi (MS) ile uyumlulukları nedeniyle tercih edilen kromatografik mod olarak durur.
Adım 3. Veri analizi
Poli(A) kuyruk uzunluğu ve göreceli bolluğu, tepe noktalarının sayısına ve yoğunluğunun adenosin kütlesine bölünmesine bağlıdır. Kütle spektrumunun işlenmesi veya ayrıştırılması üzerine, 100 mer poli(A) kuyruğunun (kutuda 33,163 Da) beklenen kütlesi, adenozin (A) kütlesine eşdeğer, 329 amu aralıklı bir dizi kütle ile birlikte fark edilir. .
LC-MS ile 3' poli(A) Karakterizasyonu Örneği
Yaohai-BioPharma, mRNA 3' poli(A) karakterizasyonu için RNaz T1 bölünmesi ve IP-RP-HPLC/LC-MS dahil olmak üzere sağlam bir yöntem geliştirmiştir.
Yaohai-BioPharma, mRNA 3' poli(A) karakterizasyonu için RNaz T1 bölünmesi ve IP-RP-HPLC/LC-MS dahil olmak üzere sağlam bir yöntem geliştirmiştir.
EN
