mRNA 5'kapama Verimliliği
mRNA 5'capping Verimlilik Analizinin Önemi
MRNA'nın 5' ucunda yer alan başlık yapısı, mRNA'ların ökaryotlarda etkili translasyonu, stabilizasyonu ve taşınmasında çok önemli bir rol oynar. İn vitro kopyalanmış (IVT) mRNA bağlamında, 5' başlığı, ortak transkripsiyonel kapatma veya enzimatik kapatma işlemleri yoluyla eklenir. IVT RNA'larının vazgeçilmez bir bileşeni olarak 5' başlığı, süreç geliştirme ve toplu sürüm boyunca kapsamlı karakterizasyon gerektiren kritik bir kalite özelliği (CQA) olarak duruyor.
Yaohai-Bio Pharma, oligonükleotid atelleri (prob) tasarımı, RNaz H bölünmesi, IP-RP-İyon çifti ters fazlı yüksek performanslı sıvı kromatografisi (IP-RP-HPLC)/sıvı kromatografisini kapsayan kapsamlı 5' kapatma verimliliği analiz çözümleri sunar. -kütle spektrometresi (LC-MS), veri analizi.
mRNA bütünlüğü için Düzenleyici Gereksinimler
Dünya Sağlık Örgütü'nün düzenleyici hususlarına göre, "mRNA'nın yapısının bütünlüğü, mRNA'nın salınması için kritik bir kalite özelliği olarak kabul edilir. Bu nedenle mRNA bütünlüğü, 5' kapatma verimliliği, 3' poli(A) kuyruk varlığı veya uzunluğu vb. için kontrol gereklidir."
Analitik metod
Analiz |
Yöntemler |
mRNA 5'kapama Verimliliği |
LSindirimden sonra C-MS |
Prosedür
Adım 1. Oligonükleotid splint (prob) tasarımı
2'-O-metilnükleotidleri ve tetradeoksiribonükleotidleri içeren bölünme probu, RNase H mevcut olduğunda tamamlayıcı bir RNA zincirini spesifik pozisyonlarda ayırmaya hizmet eder. Bu yöntemin, daha büyük RNA parçalarının hedeflenen üretimi için oldukça değerli olduğu kanıtlanmıştır.
Adım 2. RNaz H bölünmesi
Stratejik olarak mRNA'nın 5' ucunu tamamlayıcı olacak şekilde tasarlanmış biyotinlenmiş bir prob, bir başlık yapısına sahip olan 5' ucu oligonükleotidin hedeflenen bölünmesini katalize etmek için RNase H ile birlikte uygulanır.
Adım 3. IP-RP-HPLC/LC-MS
Oligonükleotid LC-MS analizinde tercih edilen kromatografik mod, amin mobil faz katkı maddelerinin kullanıldığı iyon eşleştirmeli ters faz (IP-RP) ayırmalarıdır. Bu onların üstün çözme gücüne ve kütle spektrometresi (MS) ile uyumluluğuna atfedilir.
Adım4. Veri analizi
Difosfat, trifosfat veya metillenmemiş G başlığına (GpppG) sahip olanların aksine, bir m7GpppG başlığına sahip bölünme parçalarında gözlemlenen farklı kütleler, bunların tanımlanmasını kolaylaştırır ve kapatma verimliliğinin tahmin edilmesini sağlar.
LC-MS ile verimlilik analizinin sınırlanması örneği
Yaohai-Bio Pharma, oligonükleotid atelleri (prob) tasarımı, RNase H bölünmesi, IP-RP-HPLC/LC-MS'den veri analizine kadar mRNA kapatma verimliliği analizi için güçlü yöntemler geliştirmiştir.
5' uçtaki bölünme fragmanlarının toplam iyon kromatogramları (solda) ve elektrosprey kütle spektrumları (sağda)
EN
