U vezi sa pripremom prethodnika RNA u seriji, često korišćena metoda je transkripcija in vitro (IVT). Reakcija IVT koristi linearizovani plazmidni DNA koji sadrži T7 promotor kao šablon i sintetizuje prethodnik RNA uz upotrebu nukleotidnih trifosfata (NTP) kao subtrata u prisustvu T7 RNA polimeraze.
Metode cikliranja in vitro uključuju hemijsku ligaciju, enzimsku ligaciju i metod permutovanog introna-eksona (PIE). Hemijska i enzimska ligacija su pogodne za cikliranje kraćih RNA. Kada je fragment veći od 100 nt, brzina cikliranja će znatno smanjiti. U suprotnosti, metoda bazirana na sistemu PIE može ostvariti cikliranje nizova dužine 8 kb.
Pod dejstvom guanozin trifosfata (GTP), PIE struktura pređe ciklizaciju ekstra-intron sekvenca. U kombinaciji sa racionalnom strategijom za povećanje brzine ciklizacije, Yaohai Bio-Pharma može da postigne ciklizaciju sekvenci do 4 kb dužine, sa efikasnošću ciklizacije većom od 80%.
In vitro reakcija ciklizacije RNA protiče na sledeći način:
Prethodnik RNA sintetizovan je in vitro transkripcijom, a PIE komponenta završava samospajanje pod dejstvom GTP-a kako bi formirala circRNA.
Процес | Detalji usluge | Rok isporuke (radni dan) |
Transkripcija i cirkulacija in vitro | Potvrda reakcionog sistema | 1-2 |
Reakcije Transkripcije U Vitro i Ciklizacije | ||
Dijagnoza RNase R | ||
Optimizacija reakcije | Sastav Reakcije, Optimizacija Vremena | 2-5 |
Postignuti mogu do 4 kb RNA ciklizacije.
Kroz racionalnu strategiju optimizacije niza može se postići stopa ciklizacije veća od 80%.
Putem stroge kontrole RNasa u eksperimentalnom okruženju i potrošnjaku, učinkovito se sprečava degradacija RNA.
In vitro ciklizacija i obogaćavanje circRNA
Na osnovu PIE sistema, Yaohai Bio-Pharma je optimizovala niz circRNA, sa stopom ciklizacije većom od 80% prema elektroforezi na agaroznom gełu (AGE). Korišćenjem RNase R za obogaćavanje circRNA, rezultati E-gel elektroforeze pokazuju da je linearni RNA prethodnik razbijen, a nakon daljeg čišćenja, većina oštećene circRNA može biti uklonjena. Rezolucija je samodevna od strane Yaohai Bio-Pharma.
In vitro cirkulacija i obogaćavanje circRNA