Karakterizacija mRNA 3' poli(A).
Karakterizacija mRNA 3' poli(A).
3' poli(A) rep (poliadenozini) mRNA je sestavni del posttranskripcijske regulacije, ki vpliva na izvoz, stabilnost in prevod mRNA. V primeru in vitro transkribiranih (IVT) mRNA se poli(A) rep uvede bodisi med ko-transkripcijo na šablonski način bodisi prek encimskega repnega procesa na nešablonski način. Ta 3' poli(A) služi kot kritični atribut kakovosti (CQA) za IVT RNA, kar zahteva temeljito karakterizacijo tako med razvojem procesa kot med izdajo serije.
Yaohai Bio-Pharma zagotavlja specializirane storitve karakterizacije 3' poli(A) z uporabo tehnik, kot so cepitev z ribonukleazo T1 (RNase T1), tekočinska kromatografija visoke ločljivosti z reverzno fazo (IP-RP-HPLC)/tekočinska kromatografija-masna spektrometrija (LC-MS) in celovito analizo podatkov.
Regulativne zahteve za karakterizacijo mRNA 3' poly(A).
V skladu z regulativnimi premisleki SZO se »celovitost strukture mRNA šteje za kritično kakovostno lastnost za sproščanje mRNA. Zato je potreben nadzor za celovitost mRNA, učinkovitost zapiranja 5', prisotnost ali dolžino repa 3' poli(A) in tako naprej.«
Analitična metoda
Analiza | Metode |
Karakterizacija mRNA 3' poli(A). | LC-MS po prebavi |
Postopek
Korak 1. Cepitev RNaze T1
Neposredna analiza nepoškodovane mRNA v polni dolžini z LC-MS je nepraktična zaradi njene velikosti in heterogenosti. Če želite pregledati poli(A) rep, ga je treba odcepiti od mRNA polne dolžine. Prevladujoča metoda vključuje encimsko razgradnjo z RNazo T1, selektivno cepi 3' konec rG, medtem ko ohranja zaporedje poli(A). Vzorec mRNA je podvržen razgradnji z RNazo T1 in fragmenti cepitve, ki vsebujejo raztezke poli(A), se izolirajo z uporabo magnetnih kroglic, prevlečenih z oligo dT.
Korak 2. IP-RP-HPLC/LC-MS
Ekstrahirani repi so bili analizirani z uporabo LC-MS, ki je ponudila natančne informacije o dolžini repa pri ločljivosti enega nukleotida. Pri analizi oligonukleotidov LC-MS je prednostni kromatografski način ločevanja z reverzno fazo z ionskim parom (IP-RP) z aditivi mobilne faze aminov zaradi njihove močne ločljivosti in združljivosti z masno spektrometrijo (MS).
Korak 3. Analiza podatkov
Dolžina poli(A) repa in njegova relativna abundanca sta odvisni od števila in intenzivnosti vrhov, deljenih z maso adenozina. Po obdelavi ali dekonvoluciji masnega spektra je razvidna pričakovana masa 100-mernega poli(A) repa (33,163 Da v škatli), ki jo spremlja niz mas, razporejenih za 329 amu, kar je enako masi adenozina (A) .
Primer 3' poli(A) karakterizacije z LC–MS
Yaohai-BioPharma je razvila robustno metodo za karakterizacijo mRNA 3' poli(A), vključno s cepitvijo RNaze T1 in IP-RP-HPLC/LC-MS.
Yaohai-BioPharma je razvila robustno metodo za karakterizacijo mRNA 3' poli(A), vključno s cepitvijo RNaze T1 in IP-RP-HPLC/LC-MS.
EN
