Učinkovitost omejevanja mRNA 5'
Pomen analize učinkovitosti mRNA 5'capping
Struktura kapice, ki se nahaja na 5' koncu mRNA, ima ključno vlogo pri učinkovitem prevajanju, stabilizaciji in transportu mRNA znotraj evkariontov. V kontekstu in vitro prepisane (IVT) mRNA se 5' kapica uvede bodisi s ko-transkripcijskim omejevanjem bodisi s postopki encimskega omejevanja. Kot nepogrešljiva komponenta IVT RNA je 5' kapica kritični atribut kakovosti (CQA), ki zahteva celovito karakterizacijo skozi razvoj procesa in izdajo serije.
Yaohai-Bio Pharma ponuja celovite rešitve za analizo učinkovitosti 5' capping, ki zajemajo zasnovo oligonukleotidnih opornikov (sonde), cepitev RNaze H, tekočinsko kromatografijo visoke ločljivosti z reverzno fazo IP-RP-ionskih parov (IP-RP-HPLC)/tekočinsko kromatografijo -masna spektrometrija (LC-MS), analiza podatkov.
Regulativne zahteve za celovitost mRNA
V skladu z regulativnimi premisleki SZO se »celovitost strukture mRNA šteje za kritično kakovostno lastnost za sproščanje mRNA. Zato je potreben nadzor za celovitost mRNA, učinkovitost zapiranja 5', prisotnost ali dolžino repa 3' poli(A) in tako naprej.«
Analitična metoda
Analiza |
Metode |
Učinkovitost omejevanja mRNA 5' |
LC-MS po prebavi |
Postopek
1. korak. Zasnova oligonukleotidnih opornic (sonde).
Sonda za cepitev, ki vključuje 2'-O-metilnukleotide in tetradeoksiribonukleotide, služi za cepitev komplementarne verige RNA na specifičnih položajih, ko je prisotna RNaza H. Ta metoda se je izkazala za zelo dragoceno za ciljno generiranje večjih fragmentov RNA.
Korak 2. RNaza H cepitev
Biotinilirana sonda, ki je strateško zasnovana tako, da je komplementarna 5'-koncu mRNA, se uporabi v povezavi z RNazo H, da katalizira ciljno cepitev 5'-končnega oligonukleotida, ki ima pokrovno strukturo.
Korak 3. IP-RP-HPLC/LC-MS
Pri analizi oligonukleotidov LC-MS je prednostni kromatografski način ločevanje z reverzno fazo z ionskim parom (IP-RP) z uporabo aditivov mobilne faze amina. To pripisujejo njihovi vrhunski ločljivosti in združljivosti z masno spektrometrijo (MS).
4. korak. Analiza podatkov
Različne mase, opažene v fragmentih cepitve s pokrovčkom m7GpppG, v nasprotju s tistimi z difosfatnim, trifosfatnim ali nemetiliranim pokrovčkom G (GpppG), olajšajo njihovo identifikacijo in omogočajo oceno učinkovitosti omejevanja.
Primer analize učinkovitosti omejevanja z LC–MS
Yaohai-Bio Pharma je razvil robustne metode za analizo učinkovitosti omejevanja mRNA, od zasnove oligonukleotidnih opornikov (sonde), cepitve RNaze H, IP-RP-HPLC/LC-MS do analize podatkov.
Skupni ionski kromatogrami (levo) in masni spektri elektrospreja (desno) 5'-končnih fragmentov cepitve
EN
