Innovative monteringsteknikker for storskala gensyntese

Monteringsteknologien for å syntetisere store DNA-fragmenter fra bunnen av er hjørnesteinen i gensyntese, og omfatter metoder som BioBrick™, TAR, BglBrick, Golden Gate, Gibson-montering, CPEC og Overlapp PCR. På grunn av begrensningene til dagens teknologi i nøyaktig syntetisering av DNA av genlengde i et enkelt trinn, er det nødvendig å kombinere in vitro og in vivo monteringsteknikker for å sette sammen oligonukleotidfragmenter syntetisert i segmenter til lange DNA-fragmenter.

In vitro monteringsteknikker

De er klassifisert i ulike metoder basert på fragmentstørrelse og sekvensegenskaper, med et felles krav for bruk av verktøyenzymer. Overlapp PCR, basert på DNA-polymerasemetoden, er enkel og rask i drift. BioBrick- og BglBrick-metodene, som er avhengige av isoschizomerer, muliggjør standardisert montering, selv om BioBrick-metoden er uegnet for fusjonsproteiner. Golden Gate-kloningsmetoden, basert på type IIS-restriksjonsenzymer, tillater effektiv sømløs ligering av flere fragmenter. Gibson-monteringsmetoden, som bruker en kombinasjon av flere verktøyenzymer, muliggjør sømløs ligering med fragmentstørrelser som når flere hundre kb. Den standardiserte utformingen av DNA-komponenter øker utnyttelsesgraden av eksisterende fragmenter.

In vivo monteringsteknikker

Selv vitro sammensatte fragmenter kan nå flere hundre kb i størrelse, utbyttet er ofte utilstrekkelig, noe som nødvendiggjør amplifikasjon ved bruk av organismer som f.eks. Escherichia coli. For å sette sammen fragmenter som overstiger 20 kb, brukes ofte rekombinante systemer i organismer, inkludert Bacillus subtilis, gjær og konstruerte bakterier. Gjær, som en vanlig brukt vert, har blitt anerkjent for sin effektive homologe rekombinasjonsevne i mange år. Den kan brukes til å sette sammen kunstige kromosomer opp til flere megabaser (Mb) i lengde. I tillegg viser Saccharomyces cerevisiae en ekstraordinær toleranse for kromosomlengde, og gir et teoretisk grunnlag for å bruke gjær til å konstruere ultralange kromosomer i høyere organismer.

Applikasjoner

Yaohai Bio-Pharma bruker primært to monteringsmetoder for gensyntese: ligasesammenstilling og DNA-polymerasemontering. Ligasesammenstillingsmetoden kobler overlappende og hybridiserte 5'-fosforylerte oligonukleotidfragmenter til dobbelttrådet DNA ved bruk av DNA-ligase. Polymerasesammenstillingsmetoden bruker DNA-polymerase for å utvide de overlappende oligonukleotidfragmentene gjennom hybridisering, oppnå en blanding av forskjellige lengder, og til slutt amplifisere de vellykket sammensatte fulllengdefragmentene ved bruk av primere. Yaohai's kan hjelpe klienter med å tilfredsstille spesifikke krav i gensyntese.

Vi søker også aktivt etter institusjonelle eller individuelle globale partnere. Vi tilbyr den mest konkurransedyktige kompensasjonen i bransjen. Hvis du har spørsmål, kan du gjerne kontakte oss: [email protected]