mRNA polyA-karakterisering

mRNA 3'-poly(A)-karakterisering

De 3'-poly(A)-staart (polyadenosines) van mRNA is een integraal onderdeel van post-transcriptionele regulatie en beïnvloedt de export, stabiliteit en translatie van mRNA. In het geval van in vitro getranscribeerde (IVT) mRNA's wordt de poly(A)-staart geïntroduceerd tijdens co-transcriptie op een matrijsachtige manier of via een enzymatisch staartproces op een niet-matrijsachtige manier. Deze 3'-poly(A) dient als een kritisch kwaliteitsattribuut (CQA) voor IVT-RNA's, waardoor een grondige karakterisering nodig is tijdens zowel procesontwikkeling als batchvrijgave.

Yaohai Bio-Pharma levert gespecialiseerde 3'-poly(A)-karakteriseringsdiensten, waarbij gebruik wordt gemaakt van technieken zoals ribonuclease T1 (RNase T1)-splitsing, ionenpaar omgekeerde fase hogeprestatievloeistofchromatografie (IP-RP-HPLC)/vloeistofchromatografie-massaspectrometrie (LC-MS) en uitgebreide data-analyse.

Regelgevende vereisten voor mRNA 3'-poly(A)-karakterisering

Volgens de regelgevingsoverwegingen van de WHO wordt “de integriteit van de structuur van het mRNA beschouwd als een cruciaal kwaliteitsattribuut voor de vrijgave van het mRNA. Er is dus controle nodig voor de mRNA-integriteit, de 5’-capping-efficiëntie, de aanwezigheid of lengte van de 3’-poly(A)-staart, enzovoort.’

Analytische methode

Procedure

Stap 1. RNase T1-splitsing

Directe analyse van intact mRNA over de volledige lengte door LC-MS is onpraktisch vanwege de omvang en heterogeniteit ervan. Om de poly(A)-staart te onderzoeken, moet deze worden afgesplitst van het mRNA met de volledige lengte. De meest voorkomende methode omvat enzymatische vertering met RNase T1, waarbij het 3'-uiteinde van rG selectief wordt gesplitst terwijl de poly (A) -sequentie behouden blijft. Het mRNA-monster ondergaat vertering met RNase T1, en splitsingsfragmenten die poly(A)-stukken bevatten, worden geïsoleerd met behulp van met oligo-dT gecoate magnetische kralen.

Stap 2. IP-RP-HPLC/LC-MS

De geëxtraheerde staarten werden geanalyseerd met behulp van LC-MS, wat nauwkeurige informatie over de staartlengte opleverde met een resolutie van één nucleotide. Bij oligonucleotide LC-MS-analyse zijn ionenparende omgekeerde-fase (IP-RP)-scheidingen met amine-mobiele-fase-additieven de voorkeurschromatografische modus, vanwege hun robuuste oplossend vermogen en compatibiliteit met massaspectrometrie (MS).

Stap 3. Data-analyse

De poly(A)-staartlengte en de relatieve overvloed ervan hangen af ​​van het aantal en de intensiteit van de pieken gedeeld door de massa adenosine. Bij het verwerken of deconvolueren van het massaspectrum wordt de verwachte massa van een 100-meer poly(A)-staart (33,163 Da in doos) onderscheiden, vergezeld van een reeks massa's met een onderlinge afstand van 329 amu, equivalent aan de massa van adenosine (A). .

Geval van 3'-poly(A)-karakterisering met LC-MS

Yaohai-BioPharma heeft een robuuste methode ontwikkeld voor de karakterisering van mRNA 3' poly(A), inclusief RNase T1-splitsing en IP-RP-HPLC/LC-MS.

Yaohai-BioPharma heeft een robuuste methode ontwikkeld voor de karakterisering van mRNA 3' poly(A), inclusief RNase T1-splitsing en IP-RP-HPLC/LC-MS.