mRNA 5'-capping-efficiëntie
De betekenis van mRNA 5'capping-efficiëntieanalyse
De kapstructuur aan het 5'-uiteinde van mRNA speelt een cruciale rol bij de efficiënte vertaling, stabilisatie en transport van mRNA's binnen eukaryoten. In de context van in vitro getranscribeerd (IVT) mRNA wordt de 5'-cap geïntroduceerd via co-transcriptionele capping- of enzymatische capping-processen. Als een onmisbaar onderdeel van IVT-RNA's fungeert de 5'-dop als een kritisch kwaliteitsattribuut (CQA) dat uitgebreide karakterisering tijdens de procesontwikkeling en batchvrijgave noodzakelijk maakt.
Yaohai-Bio Pharma biedt uitgebreide oplossingen voor analyse van de efficiëntie van 5'-capping, waaronder het ontwerp van oligonucleotide-spalken (sonde), RNase H-splitsing, IP-RP-ionenpaar omgekeerde fase krachtige vloeistofchromatografie (IP-RP-HPLC)/vloeistofchromatografie -massaspectrometrie (LC-MS), data-analyse.
Regelgevende vereisten voor mRNA-integriteit
Volgens de regelgevingsoverwegingen van de WHO wordt “de integriteit van de structuur van het mRNA beschouwd als een cruciaal kwaliteitsattribuut voor de vrijgave van het mRNA. Er is dus controle nodig voor de mRNA-integriteit, de 5’-capping-efficiëntie, de aanwezigheid of lengte van de 3’-poly(A)-staart, enzovoort.’
Analytische methode
Analyse |
Methoden |
mRNA 5'-capping-efficiëntie |
LC-MS na vertering |
Procedure
Stap 1. Ontwerp van oligonucleotide-spalken (sonde).
De splitsingsprobe, waarin 2'-O-methylnucleotiden en tetradeoxyribonucleotiden zijn opgenomen, dient voor het splitsen van een complementaire RNA-streng op specifieke posities wanneer RNase H aanwezig is. Deze methode blijkt zeer waardevol voor het gericht genereren van grotere RNA-fragmenten.
Stap 2. RNase H-splitsing
Een gebiotinyleerde probe, strategisch ontworpen om complementair te zijn aan het 5'-uiteinde van mRNA, wordt toegepast in combinatie met RNase H om de gerichte splitsing van het 5'-uiteinde-oligonucleotide dat een cap-structuur bezit, te katalyseren.
Stap 3. IP-RP-HPLC/LC-MS
Bij oligonucleotide LC-MS-analyse is de geprefereerde chromatografische modus het gebruik van ionenparende omgekeerde-fase (IP-RP)-scheidingen met behulp van amine-mobiele fase-additieven. Dit wordt toegeschreven aan hun superieure oplossend vermogen en compatibiliteit met massaspectrometrie (MS).
Stap 4. Gegevensanalyse
Verschillende massa's waargenomen in splitsingsfragmenten met een m7GpppG-dop, in tegenstelling tot die met een difosfaat, trifosfaat of niet-gemethyleerde G-dop (GpppG), vergemakkelijken hun identificatie en maken de schatting van de capping-efficiëntie mogelijk.
Geval van capping-efficiëntieanalyse met LC-MS
Yaohai-Bio Pharma heeft robuuste methoden ontwikkeld voor analyse van de efficiëntie van mRNA-capping, van het ontwerp van oligonucleotide-spalken (probe), RNase H-splitsing, IP-RP-HPLC/LC-MS tot data-analyse.
De totale ionenchromatogrammen (links) en elektrospray-massaspectra (rechts) van 5'-uiteinde-splitsingsfragmenten
EN
