대규모 유전자 합성을 위한 혁신적인 조립 기술

스크래치로부터 큰 DNA 조각을 합성하는 조립 기술은 BioBrick™, TAR, BglBrick, Golden Gate, Gibson assembly, CPEC 및 Overlap PCR과 같은 방법을 포함하여 유전자 합성의 기반이 됩니다. 현재 기술이 한 번에 유전자 길이의 DNA를 정확하게 합성하는 데 제한이 있기 때문에, 세그먼트별로 합성된 올리고핵산 조각들을 긴 DNA 조각으로 조립하기 위해 in vitro와 in vivo 조립 기술을 결합할 필요가 있습니다.

In vitro 조립 기술

그들은 조각 크기와 서열 특성에 따라 다양한 방법으로 분류되며, 공통적으로 도구 효소의 사용이 요구됩니다. 중복 PCR은 DNA 폴리머라스 방법을 기반으로 하여 간단하고 신속하게 작동합니다. BioBrick과 BglBrick 방법은 동일한 효소를 이용하여 표준화된 조립이 가능하지만, BioBrick 방법은 융합 단백질에 적합하지 않습니다. Golden Gate 클로닝 방법은 type IIS 제한효소를 기반으로 다수의 조각을 효율적으로 무逢합 연결할 수 있습니다. Gibson 조립 방법은 여러 도구 효소의 조합을 이용하여 조각 크기가 수백 kb에 이를 때도 무逢합 연결이 가능합니다. DNA 구성요소의 표준화된 설계는 기존 조각의 활용률을 높입니다.

체내 조립 기술

비록 체외에서 조립된 조각 크기는 수백 kb에 이를 수 있으나, 수율이 충분하지 않아 다음과 같은 생물체를 이용한 증폭이 필요합니다. 대장균 20 kb를 초과하는 조각들을 조립할 때는 종종 Bacillus subtilis, 효모, 그리고 공학적으로 설계된 박테리아와 같은 생체 내 재조합 시스템이 사용됩니다. 효모는 오랫동안 효율적인 동원적 재조합 능력 때문에 일반적으로 사용되는 호스트로 알려져 있습니다. 이는 수 메가베이스(Mb) 길이에 달하는 인공 염색체를 조립하는 데 사용될 수 있습니다. 또한, Saccharomyces cerevisiae는 염색체 길이에 대해 매우 높은 내성을 보여주어, 이를 통해 효모를 이용하여 고등 생물에서 초장 염색체를 구축할 수 있는 이론적 기반을 제공합니다.

응용 프로그램

Yaohai Bio-Pharma는 유전자 합성을 위해 두 가지 조립 방법을 주로 사용합니다: 리가제 조립 및 DNA 폴리머라제 조립입니다. 리가제 조립 방법은 5'-인산화된 올리고핵산 조각들을 DNA 리가제를 사용하여 교차하고 하이브리드화된 이중 사슬 DNA로 연결합니다. 폴리머라제 조립 방법은 DNA 폴리머라제를 사용하여 교차하는 올리고핵산 조각들을 하이브리드화하여 다양한 길이의 혼합물을 얻고, 마지막으로 프라이머를 사용하여 성공적으로 조립된 전체 길이의 조각들을 증폭합니다. Yaohai는 고객의 특정 요구사항을 충족하도록 도와드립니다.

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