대규모 유전자 합성을 위한 혁신적인 조립 기술

처음부터 큰 DNA 단편을 합성하기 위한 조립 기술은 BioBrick™, TAR, BglBrick, Golden Gate, Gibson 조립, CPEC, Overlap PCR과 같은 방법을 포함하는 유전자 합성의 초석입니다. 단일 단계에서 유전자 길이의 DNA를 정확하게 합성하는 데 현재 기술의 한계로 인해 세그먼트로 합성된 올리고뉴클레오타이드 단편을 긴 DNA 단편으로 조립하기 위해 시험관 내 및 생체 내 조립 기술을 결합해야 합니다.

시험관 내 조립 기술

이들은 단편 크기와 서열 특성에 따라 다양한 방법으로 분류되며, 도구 효소를 사용해야 한다는 공통적인 요구 사항이 있습니다. DNA 중합효소 방법을 기반으로 하는 오버랩 PCR은 간단하고 빠르게 작동합니다. 등분산체에 의존하는 BioBrick 및 BglBrick 방법은 표준화된 조립을 가능하게 하지만 BioBrick 방법은 융합 단백질에 적합하지 않습니다. IIS 제한 효소를 기반으로 하는 Golden Gate 클로닝 방법은 여러 단편의 효율적인 원활한 연결을 가능하게 합니다. 여러 도구 효소의 조합을 활용하는 Gibson 조립 방법은 수백 kb에 달하는 단편 크기로 원활한 연결을 가능하게 합니다. DNA 구성 요소의 표준화된 설계는 기존 단편의 활용률을 향상시킵니다.

생체 내 조립 기술

이기는하지만 체외에서 조립된 단편은 크기가 수백 kb에 달할 수 있으며 수확량이 종종 부족하여 다음과 같은 생물체를 사용한 증폭이 필요합니다. 대장균. 20kb를 초과하는 단편을 조립할 때, Bacillus subtilis, 효모, 엔지니어링 박테리아를 포함한 유기체 내의 재조합 시스템이 종종 사용됩니다. 일반적으로 사용되는 숙주인 효모는 수년 동안 효율적인 상동 재조합 능력으로 인정받아 왔습니다. 최대 수 메가베이스(Mb) 길이의 인공 염색체를 조립하는 데 사용할 수 있습니다. 또한, Saccharomyces cerevisiae는 염색체 길이에 대한 놀라운 내성을 보여, 효모를 이용하여 고등 유기체에서 매우 긴 염색체를 구성하는 이론적 근거를 제공합니다.

어플리케이션

Yaohai Bio-Pharma는 주로 유전자 합성을 위해 리가제 조립과 DNA 중합효소 조립이라는 두 가지 조립 방법을 사용합니다. 리가제 조립 방법은 DNA 리가제를 사용하여 겹치고 혼성화된 5'-인산화 올리고뉴클레오타이드 단편을 이중 가닥 DNA로 연결합니다. 중합효소 조립 방법은 DNA 중합효소를 사용하여 혼성화를 통해 겹치는 올리고뉴클레오타이드 단편을 확장하여 다양한 길이의 혼합물을 얻고 마지막으로 프라이머를 사용하여 성공적으로 조립된 전체 길이 단편을 증폭합니다. Yaohai는 고객이 유전자 합성에서 특정 요구 사항을 충족하도록 도울 수 있습니다.

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