IVT mRNA:n valmistus

In vitro -transkriptio (IVT) on suosittu menetelmä mRNA:n valmistukseen, joka pystyy tuottamaan mikrogrammeja tai jopa milligrammeja mRNA:ta laboratoriotasolla. Tutkimustarkoituksiin reagenttien toimittajat ovat kehittäneet monipuolisia IVT-reaktiojärjestelmiä, jotka sopivat kohtalaisen pitkälle mRNA:lle (1000-4000 nukleotiinia).

Tässä artikkelissa yhteenvetoa in vitro -transkriptiosta (IVT) mRNA:sta, mukaan lukien perinteinen IVT-reaktiojärjestelmä, jota käytetään laboratoriotasolla, sekä IVT-reaktiojärjestelmä, joka sopii ultra-pitkälle mRNA:lle (>9000 nukleotiinia).

Kitsit mahdollistavat samanaikaisen kappaleen kanssa CleanCap AG:lla ja vähentävät immunogeneettisuutta m1ψ:n avulla. DNase I poistaa jäljellä olevan DNA:n. Matala tuotos voi johtua huonosta sekoittamisesta, reagenttien hapanemisesta tai DNA-mallineen ongelmista, joita voidaan lievittää keskipisteellä pyörittämällä, käyttämällä uusia reagenteja, kontrolioimalla ja säätämällä mallineen määrää/reaktiokautta.

Yaohai Bio-Pharma tarjoaa erilaisia valmiita IVT RNA -tuotteita (vedesikäyttöinen tai jäännös) ja LNP-lopputuotteita, jotka koodaavat proteiineja, kuten fluoresoivia proteiineja (eGFP, mCHERRY), luciferaasi, rekombinaasi Cre ja antigeni OVA, täyttääkseen erilaiset kokeelliset tai projektitarpeet.

JättiläismRNA:lle suunnattu IVT-järjestelmä

Perinteinen IVT ei välttämättä toimi liian pitkille mRNA:lle (>9000 nt). IVT-komponenttien syvällistä ymmärrystä ja järkevää säätämistä on tarpeen.

DNA-mallipohja: Linearisoituja plasmiditai PCR-tuotteita, joissa on vastaavat promotorisekvenssit, hajoamaton RNase-vapaa H2O. DNA-mallipohjan suositeltava konseentraatio on yli 40 nM optimaalisten IVT-olojen varmistamiseksi.

DTT: Ylläpitää enzyymiaktiivisuutta transkriptaation aikana. Uusi DTT tulisi lisätä reaktio-buffereihin optimaalisen enzyymiaktiivisuuden varmistamiseksi.

RNase-estäjä: Estää RNase-aktiivisuuden ja ylläpitää mRNA:n vakautta.

T7 RNA-polymeeraasi: Katalysoi DNA:n transkription RNA:ksi, joka vastaa promotorisekvenssiä. T7 RNA-polymerasaan vaikuttaa pH ja magneesiumioni.

Magneesiumiot (Mg2+): RNA-polymerasin kofaktori. Liian alhaiset konsentraatiot vähentävät transkriptioeffektiivisyyttä, kun taas liian korkeat konsentraatiot johtavat RNA:n hajoamiseen. Vapaan [Mg2+] tulisi säädellä riippuen nukleotiidikonsentraatiosta. Jokainen nukleotiidi sidoo yhden [Mg2+], joten [Mg2+] konsentraation tulisi ylittää kokonaisnukleotiidikonsentraatio.

Nukleosiditrifosfaatit (NTP): Substraateina NTP:t ovat RNA:n perusyksiköitä. Yli 7 mM:n NTP-konsentraatiot vaikuttavat myönteisesti mRNA-tuotantoon.

Spermiini: Vakauttaa DNA-ensiimayhdisteitä ja stimuloi transkriptioreaktioita; kuitenkin liian korkeat konsentraatiot voivat olla inhibitoivia. Suositeltu spermiinikonsentraatio on 1–3 mM välillä.

Inorgaaninen pyrofosfaasi (PPase): Lisätty IVT-reaktioihin estääkseen epäorganisten pyrofosfaattiionien (PPi) kertymisen, välttääkseen niiden cheloinnin Mg2+-kanssa ja varmistaa riittävän vapauden Mg2+.

Hyödyntämällä edelläkävää teknologiaa ja IVT-mRNA-kokemusta Yaohai Bio-Pharma tarjoaa yhdenmuotoisen IVT-RNA-palvelun, joka kattaa sekvenssien suunnittelun, IVT-RNA-valmistuksen (m1ψ -muokkauksin), RNA-syklisoituksen, puhdistuksen, lyovilaisen, LNP-pakkaamisen ja laadintarkastuksen.

Hakemme myös aktiivisesti globaaleja kumppaneita instituutioilta tai yksilöiltä. Tarjoamme alan kilpailukykyisimmät palkkiot. Jos sinulla on kysymyksiä, ota meihin yhteyttä ilman epäröintiä: [email protected]