IVT mRNA:n valmistus

In vitro -transkriptio (IVT) on edullinen menetelmä mRNA:n valmistamiseksi, joka pystyy tuottamaan mikrogrammoista milligrammoihin mRNA:ta laboratoriomittakaavassa. Tutkimustarkoituksiin reagenssitoimittajat ovat kehittäneet monipuolisia IVT-reaktiojärjestelmiä, jotka sopivat kohtalaisen pituiselle mRNA:lle (1000-4000 nukleotidia).

Tässä artikkelissa teemme yhteenvedon mRNA:n in vitro -transkriptiosta (IVT), mukaan lukien laboratoriomittakaavassa käytetty perinteinen IVT-reaktiojärjestelmä ja ultrapitkälle mRNA:lle (>9000 nukleotidia) sopiva IVT-reaktiojärjestelmä.

Sarjat mahdollistavat yhteistranskription rajauksen CleanCap AG:n kanssa ja vähentävät immunogeenisuutta m1ψ:llä. DNaasi I poistaa jäännös-DNA:ta. Alhainen saanto voi johtua huonosta sekoituksesta, reagenssin hapettumisesta tai DNA-templaattiongelmista, joita voidaan lieventää sentrifugoimalla, tuoreilla reagensseilla, kontrolleilla ja säätämällä templaatin määrää/reaktioaikaa.

Yaohai Bio-Pharma tarjoaa erilaisia ​​esivalmistettuja IVT RNA -tuotteita (neste/pakastekuivattu jauhe) ja LNP-valmiita tuotteita, jotka koodaavat proteiineja, kuten fluoresoivia proteiineja (eGFP, mCHERRY), lusiferaasia, rekombinaasi Cre ja antigeeni OVA, vastaamaan erilaisiin kokeisiin tai projekteihin. tarpeisiin.

IVT-järjestelmä erittäin pitkälle mRNA:lle

Perinteinen IVT ei välttämättä toimi liian pitkälle mRNA:lle (> 9000 nt). Ammatillisen peruskoulutuksen komponenttien syvällistä ymmärrystä ja järkevää säätöä tarvitaan.

DNA-malli: Linearisoidut plasmidit tai PCR-tuotteet vastaavilla promoottorisekvensseillä liuotettuna RNaasi-vapaaseen H2O:hon. Yli 40 nM DNA-templaattipitoisuutta suositellaan optimaalisiin IVT-olosuhteisiin.

DTT: Säilyttää entsyymiaktiivisuuden transkription aikana. Tuoretta DTT:tä tulee lisätä reaktiopuskuriin optimaalisen entsyymiaktiivisuuden saavuttamiseksi.

RNaasi-inhibiittori: Estää RNaasi-aktiivisuutta ja ylläpitää mRNA:n stabiilisuutta.

T7 RNA-polymeraasi: Katalysoi DNA:n transkription RNA:ksi, joka vastaa promoottorisekvenssiä. T7-RNA-polymeraasin aktiivisuuteen vaikuttavat pH ja magnesiumionit.

Magnesiumionit (Mg2+): RNA-polymeraasin kofaktori. Liian pienet pitoisuudet vähentävät transkription tehokkuutta, kun taas liian suuret pitoisuudet johtavat RNA:n hajoamiseen. Vapaa [Mg2+] tulee säätää nukleotidipitoisuuden perusteella. Jokainen nukleotidi kelatoi yhden [Mg2+]:n, joten [Mg2+]-pitoisuuden tulisi ylittää nukleotidien kokonaispitoisuus.

Nukleosiditrifosfaatit (NTP): Substraatteina NTP:t ovat RNA:n perusyksiköitä. Yli 7 mM NTP-pitoisuuksilla on positiivinen vaikutus mRNA:n tuotantoon.

Spermidiini: Stabiloi DNA-entsyymikomplekseja ja stimuloi transkriptioreaktioita; liiallisilla pitoisuuksilla on kuitenkin estäviä vaikutuksia. Suositeltu spermidiinipitoisuus on 1-3 mM.

Epäorgaaninen pyrofosfataasi (PPaasi): Lisätty IVT-reaktioihin estämään epäorgaanisten pyrofosfaatti-ionien (PPi) kertymistä, välttäen niiden kelatoitumista Mg2+:lla ja varmistaen riittävän vapaan Mg2+:n.

Hyödyntämällä uraauurtavaa teknologiaa ja IVT-mRNA-kokemusta, Yaohai Bio-Pharma tarjoaa yhden luukun IVT RNA -palvelun, joka kattaa sekvenssisuunnittelun, IVT RNA:n valmistuksen (m1ψ modien kanssa), RNA:n syklisoinnin, puhdistuksen, pakastekuivauksen, LNP-kapseloinnin ja laatutestauksen.

Etsimme myös aktiivisesti institutionaalisia tai yksittäisiä globaaleja kumppaneita. Tarjoamme alan kilpailukykyisimmän palkkauksen. Jos sinulla on kysyttävää, ota rohkeasti yhteyttä: [email protected]