Innovatiivisia kokoamistekniikoita suuren mittakaavan geenisynteesiin

Kokoonpanotekniikka suurten DNA-fragmenttien syntetisoimiseksi tyhjästä on geenisynteesin kulmakivi, ja se sisältää menetelmät, kuten BioBrick™, TAR, BglBrick, Golden Gate, Gibson-kokoonpano, CPEC ja Overlap PCR. Johtuen nykytekniikan rajoituksista geenipituisen DNA:n täsmällisessä syntetisoinnissa yhdessä vaiheessa, on välttämätöntä yhdistää in vitro- ja in vivo -kokoonpanotekniikat segmenteinä syntetisoitujen oligonukleotidifragmenttien kokoamiseksi pitkiksi DNA-fragmenteiksi.

In vitro -kokoonpanotekniikat

Ne luokitellaan erilaisiin menetelmiin fragmentin koon ja sekvenssin ominaisuuksien perusteella, ja työkaluentsyymien käytölle on yhteinen vaatimus. DNA-polymeraasimenetelmään perustuva limitys-PCR on yksinkertainen ja nopea toimintakykyinen. Isoskitomeereihin perustuvat BioBrick- ja BglBrick-menetelmät mahdollistavat standardoidun kokoonpanon, vaikka BioBrick-menetelmä ei sovellu fuusioproteiineille. IIS-tyypin restriktioentsyymeihin perustuva Golden Gate -kloonausmenetelmä mahdollistaa useiden fragmenttien tehokkaan saumattoman ligaation. Gibsonin kokoonpanomenetelmä, joka hyödyntää useiden työkaluentsyymien yhdistelmää, mahdollistaa saumattoman ligoinnin fragmenttien koolla useisiin satoihin kb. DNA-komponenttien standardoitu suunnittelu parantaa olemassa olevien fragmenttien käyttöastetta.

In vivo -kokoonpanotekniikat

Vaikka vitro kootut fragmentit voivat olla kooltaan useita satoja kb, saanto on usein riittämätön, mikä vaatii monistamisen käyttämällä organismeja, kuten Escherichia coli. Yli 20 kb:n fragmenttien kokoamisessa käytetään usein rekombinanttijärjestelmiä organismeissa, mukaan lukien Bacillus subtilis, hiiva ja muokatut bakteerit. Hiiva, yleisesti käytetty isäntä, on tunnustettu tehokkaasta homologisesta rekombinaatiokyvystään useiden vuosien ajan. Sitä voidaan käyttää jopa usean megaemäksen (Mb) pituisten keinotekoisten kromosomien kokoamiseen. Lisäksi Saccharomyces cerevisiaella on poikkeuksellinen toleranssi kromosomien pituudelle, mikä tarjoaa teoreettisen perustan hiivan käytölle ultrapitkien kromosomien rakentamiseen korkeammissa organismeissa.

Sovellukset

Yaohai Bio-Pharma käyttää geenisynteesiin ensisijaisesti kahta kokoonpanomenetelmää: ligaasin kokoonpanoa ja DNA-polymeraasin kokoonpanoa. Ligaasin kokoamismenetelmä yhdistää päällekkäiset ja hybridisoidut 5'-fosforyloidut oligonukleotidifragmentit kaksijuosteiseksi DNA:ksi käyttämällä DNA-ligaasia. Polymeraasin kokoamismenetelmässä käytetään DNA-polymeraasia laajentamaan päällekkäisiä oligonukleotidifragmentteja hybridisaatiolla, saamaan eripituinen seos ja lopuksi monistamaan onnistuneesti kootut täyspitkät fragmentit käyttämällä alukkeita. Yaohai's voi auttaa asiakkaita täyttämään geenisynteesin erityisvaatimukset.

Etsimme myös aktiivisesti institutionaalisia tai yksittäisiä globaaleja kumppaneita. Tarjoamme alan kilpailukykyisimmän palkkauksen. Jos sinulla on kysyttävää, ota rohkeasti yhteyttä: [email protected]