Innovatiivisia kokoonpanomenetelmiä laajamittaiseen geenisynteesiin

Tekniikka, jota käytetään suurten DNA-fragmenttien kokonaisvaltaiseen synteesiin, on perustava osa geenisynteesissä, mukaan lukien menetelmät kuten BioBrick™, TAR, BglBrick, Golden Gate, Gibson-assyssä, CPEC:ssä ja Overlap PCR:ssä. Nykyisen teknologian rajoitusten takia tarkoituksenmukaisessa geenipituisten DNA:n synteesissä yhdessä vaiheessa on välttämätöntä yhdistää in vitro- ja in vivo-assyteknikat segmenteittäisesti syntetisoitujen oliigonukleotiidien fragmenttien pitkiksi DNA-fragmentteiksi.

In vitro-assyteknikat

Ne ovat luokiteltu eri menetelmiin fragmenttikoon ja sekvenssimerkintöjen perusteella, yhteisenä vaatimuksena käyttää työkaluenzymeja. Overlap PCR, joka perustuu DNA-polymeraasimenetelmään, on yksinkertainen ja nopea toiminta. BioBrick- ja BglBrick-menetelmät, jotka perustuvat isoschizomeereihin, mahdollistavat standardoituja kokoonpanoja, vaikkakin BioBrick-menetelmä ei ole soveltuva fuusioproteineille. Golden Gate -klonointimenetelmä, joka perustuu tyyppi IIS rajoitusenzymeihin, mahdollistaa tehokkaan suljetun liitosmonikon useita fragmentteja. Gibsonin kokoonpanomenetelmä, joka hyödyntää useiden työkaluenzymien yhdistelmää, mahdollistaa suljetun liiton, jonka fragmenttikoot voivat saavuttaa useita satoja kb. Standardoitu DNA-komponenttien suunnittelu parantaa olemassa olevien fragmenttien hyödyntymisastea.

In vivo -kokoonpanomenetelmät

Vaikka in vitro kokoonnetut fragmentit voivat saavuttaa useita satoja kb koon, tuotto on usein riittämätön, mikä edellyttää organismien, kuten Escherichia coli Osien kokoonpanossa, jotka ylittävät 20 kb, käytetään usein organismien sisällä olevia rekombinaattisia järjestelmiä, mukaan lukien Bacillus subtilis, hiivat ja muokatut bakteerit. Hiiva, jota käytetään usein iskuaavana isäntänä, tunnustetaan sen tehokkaasta homologisesta rekombinaatiokyvystä vuosien varrella. Sitä voidaan käyttää tekojen kromosomien kokoonpanoon, jotka voivat olla useita megabaseja (Mb) pitkiä. Lisäksi Saccharomyces cerevisiae näyttää olevan erityisen sietävä kromosomin pituudelta, mikä antaa teoreettisen perustan hiivan käytölle ultra-pitkien kromosomien rakentamiseen korkeammassa eliöissä.

SOVELLUKSET

Yaohai Bio-Pharma käyttää pääasiassa kahden montausteknologian yhdistelmää geenisynteesissä: ligasa-montausta ja DNA-polymeraasi-montausta. Ligasa-montaussa 5'-fosforyloidut oligonukleotiidipalaset, jotka toisensa päälle menevät ja hybridoivat, yhdistetään kaksiosaiseksi DNA:ksi DNA-ligasalla. Polymeraasi-montaus perustuu DNA-polymeraasin käyttöön laajentamaan toisensa päälle meneviä oligonukleotiidipalasia hybridoinnin avulla, mikä tuottaa erilaisia pituuksia sisältävän sekoituksen, ja lopulta täyspituisten palasten onnistuneet montaukset amplifioituvat alkuperäisten priimereiden avulla. Yaohai voi auttaa asiakkaita täyttämään spesifisiä vaatimuksia geenisynteesissä.

Hakemme myös aktiivisesti globaaleja kumppaneita instituutioilta tai yksilöiltä. Tarjoamme alan kilpailukykyisimmät palkkiot. Jos sinulla on kysymyksiä, ota meihin yhteyttä ilman epäröintiä: [email protected]