Fed-eräkäymisstrategian tehon hyödyntäminen

Pichia pastorista käytetään laajasti erilaisten heterologisten proteiinien tuotannossa. Fed-Batch-ruokinnan avulla toteutettu High-Cell-Density Fermentation (HCDF) -tekniikka on onnistunut saavuttamaan laajamittaisen biofarmaseuttisten valmisteiden ja teollisuusentsyymien tuotannon. Tarkasti kontrolloiduissa väliaineissa HCDF-teknologiaa käyttämällä voidaan saada korkeatuottoisia, korkea-aktiivisia ja kustannustehokkaita rekombinanttiproteiineja.

Viimeaikaiset tutkimukset osoittavat, että HCDF-strategioiden avulla pyritään lisäämään heterologisten proteiinien tuotantoa ja aktiivisuutta Pichia pastoriksessa. HCDF-teknologia mahdollistaa korkean tason soluklusterien vaivattoman saavuttamisen määritellyissä elatusaineissa, mikä mahdollistaa runsaiden rekombinanttiproteiinien hankkimisen, joilla on tehostettu aktiivisuus ja pienemmät kustannukset HCDF:n avulla. Sopivan HCDF-strategian valitseminen spesifisten proteiinien korkean tason ilmentymisen optimoimiseksi Pichia pastoriksessa on kuitenkin edelleen haaste.

High-Cell-Density Fermentation (HCDF)

Pichia pastoris loistaa heterologisten proteiinien tuotannossa, suositaan HCDF:lle automatisoiduissa bioreaktoreissa. HCDF:ssä on 3 vaihetta: glyserolierä, syöttö ja metanolin induktio. Yaohai Bio-Pharmalla on yli vuosikymmenen kokemus mikrobifermentoinnista ja se on palvellut yli 400 projektissa. Yrityksellä on laaja asiantuntemus ja hyvin kehittynyt teknologia, jonka avulla se pystyy hyödyntämään erilaisia ​​HCDF-strategioita proteiinituotannon tehostamiseksi.

Metanoli toimii sekä AOX1:n indusoijana että hiilen lähteenä, mutta sen pitoisuutta on valvottava myrkyllisyyden estämiseksi. Erilaisten metanolin ruokintastrategioiden arvioiminen on ratkaisevan tärkeää Pichia pastoriksen kasvun ja proteiinin ilmentymisen optimoimiseksi

Metanolin induktiostrategia

Syöttöerän HCDF-metanolin induktiostrategiassa tilaperusteiset induktiostrategiat sisältävät joukon ohjausmenetelmiä, jotka säätelevät metanolin lisälisää online/offline- tai eteenpäin/käänteisellä ohjauksella. Tilastollisten induktiostrategioiden joukossa tärkeimpiä ovat μ-stat, Dissolved Oxygen (DO)-stat, metanoli-stat ja biomassa-stat.

1.1 μ-tila

μ-stat-strategia pitää biomassan vakaana säätelemällä μ:tä, edistämällä toistettavuutta ja tutkimalla μ:n vaikutusta proteiinien ilmentymiseen. Siitä puuttuu kuitenkin suora metanolin ja DO:n hallinta, mikä vaarantaa kertymisen ja ROS:n muodostumisen.

1.2 DO-stat

DO-stat-strategia säätelee epäsuorasti metanolin syöttöä säätelemällä liuennutta happea hapettumisen ylläpitämiseksi, mutta se ei kiinnitä metanolipitoisuutta ja kasvunopeutta, mikä voi vaikuttaa proteiinin ilmentymisen tutkimukseen. Hapetus on haaste aerobisessa fermentaatiossa, ja vaikka puhtaan hapen lisääminen voi olla kallista ja myrkyllistä, paineen lisääminen on taloudellisempi lähestymistapa, joka voi myös lisätä proteiinien aktiivisuutta.

1.3 Metanoli-stat

Metanolipitoisuuden riittämätön hallinta rajoittaa sekä μ-stat- että DO-stat-strategioita. Metanolin tilastolliset strategiat, jotka toimivat päälle/pois-tilassa, ovat alttiita vaihteluille, eivätkä ne ole tarkkoja. Sitä vastoin PID-säätimet tarjoavat tarkemman metanolipitoisuuden säädön, mikä parantaa fermentaation yleistä tehokkuutta.

1.4 Biomassatilasto

Biomassa-stat-strategia määrittelee biomassan ja metanolin syöttämisen välisen suhteen optimoimalla metanolin syöttönopeuden proteiinisaannon parantamiseksi. Biomassan online-seuranta on käytännöllisempää, ja virtaussytometria on suositeltava menetelmä. 1000 litran mittakaavassa metanolin syöttönopeuden optimointi parantaa merkittävästi entsyymiaktiivisuutta, saantoa ja tuottavuutta, mikä ylittää pullon käymisen.

Yhteisruokintastrategia

Glyseroli AOX1-promoottorin estäjänä on kulutettava kokonaan ennen metanolin induktiota, jotta vältetään proteiinituotannon estäminen. Ko-substraatit voivat lisätä entsyymiaktiivisuutta, mutta liiallinen glyseroli voi vahingoittaa kasvua ja ilmentymistä. Sorbitoli, askorbiinihappo, mannitoli ja muut voivat korvata glyserolin, mikä vähentää proteolyysi- ja viljelyaikaa ja tehostaa proteiinien ilmentymistä.

Kantapankki edellyttää asianmukaisten säilytysmenetelmien käyttöönottoa ja sijoittamista sopivaan ympäristöön kannan ominaisuuksien stabiilisuuden ylläpitämiseksi. Yaohai Bio-Pharma pystyy täyttämään hiivan ja E. colin glyserolivaraston säilöntävaatimukset (ultramatalien pakastimien tai nestemäisen typen avulla) sekä pakastekuivaussäilöntämisen.

Rajoituksen aiheuttama strategia

Pichia pastoriksessa rajoittavat olosuhteet, kuten alhainen DO, metanolipitoisuus ja happiraja, lisäävät rekombinanttiproteiinin ilmentymistä. Happirajoitetut olosuhteet aktivoivat AOX1-promoottorin metanolin kertymisen kautta, mikä lisää proteiinin tuotantoa ja vähentää lämpöä. Matalan lämpötilan induktio parantaa saantoa, aktiivisuutta, vakautta ja solujen elinkelpoisuutta, mutta lisää jäähdytyskustannuksia. pH- ja typenrajoitus edistävät myös ilmentymistä, mikä vaatii varovaisuutta toimintaongelmien välttämiseksi. Typen rajoitus lisää merkittävästi spesifistä proteiinien tuottavuutta.

Yaohai Bio-Pharma etsii myös aktiivisesti institutionaalisia tai yksittäisiä globaaleja kumppaneita ja tarjoaa alan kilpailukykyisimmän palkkion. Jos sinulla on kysyttävää, ota rohkeasti yhteyttä: [email protected]