Fed-batch -fermentaatiotekniikan voiman käyttö

Pichia pastoris on laajalti käytössä erilaisten heterologisten proteiinien tuotannossa. Korkean solutihedden fermentaatioteknologia (HCDF), joka toteutetaan Fed-Batch -syöttämisen avulla, onnistui biolääkkeiden ja teollisuuden enzyymien suurpiirteisessä tuotannossa. Tarkasti kontrolloidussa viljelymediossa HCDF-tekniikan käyttö saa aikaan korkeankokoluonteisia, korkean aktiivisuuden ja taloudellisia rekombinantteja proteiineja.

Viimeaikaiset tutkimukset osoittavat, että HCDF-strategioita pyritään käyttämään Pichia pastorisissa tuotannon ja heterologisten proteiinien aktiivisuuden parantamiseksi. HCDF-tekniikka mahdollistaa helposti korkean soluklusterin saavuttamisen määriteltyjen viljelymedien avulla, mikä mahdollistaa runsaan rekombinanttienzymien hankkimisen korkeammalla aktiivisuudella ja alhaisemmilla kustannuksilla HCDF:n kautta. Kuitenkin sopivan HCDF-strategian valitseminen tiettyjen proteiinien korkean tason ilmaisun optimointiin Pichia pastorisissa on edelleen haaste.

High-Cell-Density Fermentation (HCDF)

Pichia pastoris on erinomaisessa asemassa heterologisten proteiinien tuotannossa, mikä tekee siitä suosituksen HCDF-menetelmää varten automatisoituissa bioreaktoreissa. HCDF koostuu kolmesta vaiheesta: glyseroli batch, syöttö ja metanoli induktio. Yaohai Bio-Pharmailla on yli kymmenen vuoden kokemus mikrobisuutteistä ja ne ovat tehneet yli 400 projektia. Yrityksellä on laaja asiantuntemus ja hyvin kehitetty teknologia, mikä mahdollistaa useiden HCDF-strategioiden käytön parantaakseen proteiinien tuotantotehokkuutta.

Metanoli toimii sekä AOX1:n induktorina että hiililähteänä, mutta sen konentuma täytyy säätää välttääkseen myrkyllisyysvaikutuksia. Erilaisten metanolin syöttöstrategioiden arviointi on keskeistä Pichia pastoris:n kasvun ja proteiinien ilmaukseen liittyvän optimoinnin kannalta.

Metanoli induktiostrategia

Osittaisessa HCDF-metanolipuutosstrategiassa tila-perustaiset puutosmenetelmät sisältävät joukon ohjausmenetelmiä, jotka säätelevät metanolin täydentävää lisäystä online/offline- tai eteenpäin/takaisinpainoisella ohjauksella. Tilastollisten puutosstrategioiden keskeiset ovat μ-stat, hajautettu syvyys (DO)-stat, metanoli-stat ja biomass-stat.

1.1 μ-stat

μ-stat-strategia pitää biomassan vakiona ohjaamalla μ:tä, mikä auttaa toistettavuudessa ja μ:n vaikutuksen tutkimisessa proteiinien ilmoitukseen. Se ei kuitenkaan hallitse suoraan metanolia eikä DO:tta, mikä voi johtaa akkumuloitumiseen ja ROS:n syntymiseen.

1.2 DO-stat

DO-stat-strategia säätelee metanolituontia epäsuorasti hallitsemalla hajautettua happea, jotta ylläpidetään hapettuneisuutta, mutta se ei kiinnitä metanolkonsentraatiota eikä kasvunopeutta, mikä voi vaikuttaa proteiinien ilmoitukseen. Hapettuneisuus on haaste aerobisessa fermointiosassa, ja vaikka puhtaata happea täydennettäessä se voi olla kalliita ja myrkyllistä, paineen lisääminen on taloudellisempi tapa, joka voi myös parantaa proteiinin aktiivisuutta.

1.3 Methanol-stat

Epätilanteellinen metanolkonsentraation hallinta asettaa rajoitteita sekä μ-stat- että DO-stat-strategioille. Metanol-statistiset strategiat, jotka toimivat päälle/off-tilassa, ovat alttiita heilahteluille ja puuttuvat tarkkuudessa. Vastaan PID-säätimet tarjoavat tarkempaa metanolkonsentraation säätöä, mikä parantaa kokonaisfermoituseffektiivisyyttä.

1.4 Biomass-stat

Biomass-stat -strategia määrittelee biomassan ja metanolin syötteen välisen suhteen, optimoimalla metanolin syöttönopeutta proteiinin tuotannon parantamiseksi. Biomassan online-seuranta on käytännöllisempää, ja virtauscytometria on suosittu menetelmä. 1000L-asteikossa metanolin syöttönopeuden optimointi parantaa merkittävästi enzyymiaktiivisuutta, tuotantoa ja tuottavuutta, ylittämällä lasifermointiongelmat.

Yhteissyöttöstrategia

Glyseroli, joka toimii AOX1-edesauttajan inhibitorina, täytyy olla kokonaan kulunut ennen metanolin induktiota välttääkseen proteiinituotannon supistamista. Yhteissubstraatit voivat parantaa enzyymiaktiivisuutta, mutta liiallinen glyseroli voi haitata kasvua ja ilmaisua. Sorbitoli, askorbiinihappo, mannitoli ja muut voivat korvata glyserolia, vähentää proteolyysia ja kasvatusajaa sekä parantaa proteiini-ilmaisua.

Painopisteen talletus vaatii asianmukaisten säilytysmenetelmien käyttöönottamista ja sijoittamisen sopivaan ympäristöön, jotta säilytetään painopisteiden ominaisuuksien vakaus. Yaohai Bio-Pharma pystyy täyttämään vaatimukset glyseroliuoksen säilyttämiselle (ultra-alhaislämpötilaisilla jäähdyttimillä tai nestemetyyliinillä) sekä hiivien ja E. colin kuivakylpy-säilyttämiselle.

Rajoituksen aiheuttama strategia

Pichia pastoris -levyssä rajoittavat ehdot, kuten matala DO, metanolipitoisuus ja happeen rajoitus parantavat rekombinanttien proteiinien tuotantoa. Happeenrajoitettomat ehdot aktivoivat AOX1-promootorin metanolikertymän kautta, mikä nostaa proteiinin tuotannon samalla kun vähentää lämpöä. Matalan lämpötilan indukointi parantaa tuotantoa, aktiivisuutta, vakautta ja solun elinkelpoisuutta, mutta lisää jäähdytyskustannuksia. pH:n ja typpirajoitus auttavat myös ilmaisussa, mutta niitä on käsiteltävä varovasti välttääkseen toiminnallisia ongelmia. Typpirajoitus parantaa huomattavasti spesifistä proteiinin tuotantoa.

Yaohai Bio-Pharma etsii myös aktiivisesti maailmanlaajuja instituutionaalisia tai yksilöllisiä kumppaneita ja tarjoaa kilpailukykyimpien palkkioita teollisuudessa. Jos sinulla on kysymyksiä, ota meihin iloisin yhteyttä: [email protected]