Характеристика 3'-поли(А) мРНК
Характеристика 3'-поли(А) мРНК
3'-поли(А)-хвост (полиаденозины) мРНК является неотъемлемой частью посттранскрипционной регуляции, влияя на экспорт, стабильность и трансляцию мРНК. В случае мРНК, транскрибируемых in vitro (IVT), поли(А)-хвост вводится либо во время совместной транскрипции шаблонным способом, либо посредством ферментативного процесса хвостообразования не матричным способом. Этот 3'-поли(А) служит критическим признаком качества (CQA) для IVT РНК, что требует тщательной характеристики как во время разработки процесса, так и во время выпуска партии.
Yaohai Bio-Pharma предоставляет специализированные услуги по определению характеристик 3'-поли(А), используя такие методы, как расщепление рибонуклеазой Т1 (РНКаза Т1), ионно-парная высокоэффективная жидкостная хроматография с обращенной фазой (IP-RP-ВЭЖХ)/жидкостная хроматография-масс-спектрометрия. (ЖХ-МС) и комплексный анализ данных.
Нормативные требования к характеристике 3'-поли(А) мРНК
Согласно нормативным соображениям ВОЗ, «целостность структуры мРНК считается критическим показателем качества высвобождения мРНК. Таким образом, необходим контроль целостности мРНК, эффективности 5'-кэпирования, наличия или длины 3'-поли(А)-хвоста и так далее».
Аналитический метод
Анализ |
методы |
Характеристика 3'-поли(А) мРНК |
LC-MS после расщепления |
Процедура
Шаг 1. Расщепление РНКазой Т1.
Прямой анализ полноразмерной интактной мРНК методом ЖХ-МС нецелесообразен из-за ее размера и гетерогенности. Чтобы исследовать хвост поли(А), его необходимо отрезать от полноразмерной мРНК. Преобладающий метод включает ферментативное расщепление РНКазой Т1, избирательно расщепляющее 3'-конец rG, сохраняя при этом последовательность поли(А). Образец мРНК подвергается расщеплению РНКазой Т1, и фрагменты расщепления, содержащие участки поли(А), выделяют с использованием магнитных шариков, покрытых олиго-дТ.
Шаг 2. IP-RP-ВЭЖХ/ЖХ-МС
Извлеченные хвосты были подвергнуты анализу с использованием ЖХ-МС, что позволило получить точную информацию о длине хвоста с разрешением в один нуклеотид. В анализе олигонуклеотидов методом ЖХ-МС разделение ионных пар в обращенной фазе (IP-RP) с добавками подвижной фазы амина является предпочтительным хроматографическим режимом благодаря их высокой разрешающей способности и совместимости с масс-спектрометрией (МС).
Шаг 3. Анализ данных
Длина хвоста поли(А) и его относительное содержание зависят от числа и интенсивности пиков, разделенных на массу аденозина. При обработке или деконволюции масс-спектра распознается ожидаемая масса 100-мерного хвоста поли(А) (33,163 329 Да в рамке), сопровождаемая серией масс, расположенных на расстоянии XNUMX а.е.м., что эквивалентно массе аденозина (А). .
Случай характеризации 3'-поли(А) с помощью ЖХ-МС
Компания Yaohai-BioPharma разработала надежный метод определения характеристик 3'-поли(А) мРНК, включая расщепление РНКазой Т1 и IP-RP-ВЭЖХ/ЖХ-МС.
Компания Yaohai-BioPharma разработала надежный метод определения характеристик 3'-поли(А) мРНК, включая расщепление РНКазой Т1 и IP-RP-ВЭЖХ/ЖХ-МС.
EN
