Эффективность 5'-кэпирования мРНК
Значение анализа эффективности 5'-кэпирования мРНК
Кэп-структура, расположенная на 5'-конце мРНК, играет ключевую роль в эффективной трансляции, стабилизации и транспортировке мРНК внутри эукариот. В контексте мРНК, транскрибируемой in vitro (IVT), 5'-кэп вводится посредством процессов котранскрипционного кэпирования или ферментативного кэпирования. Являясь незаменимым компонентом IVT РНК, 5'-кэп выступает в качестве критического атрибута качества (CQA), требующего всесторонней характеристики на протяжении всего процесса разработки и выпуска партии.
Yaohai-Bio Pharma предлагает комплексные решения для анализа эффективности 5'-кэпирования, включая разработку олигонуклеотидных шин (зондов), расщепление РНКазой H, высокоэффективную жидкостную хроматографию с обращенной фазой ионной пары (IP-RP-HPLC)/жидкостную хроматографию. -масс-спектрометрия (ЖХ-МС), анализ данных.
Нормативные требования к целостности мРНК
Согласно нормативным соображениям ВОЗ, «целостность структуры мРНК считается критическим показателем качества высвобождения мРНК. Таким образом, необходим контроль целостности мРНК, эффективности 5'-кэпирования, наличия или длины 3'-поли(А)-хвоста и так далее».
Аналитический метод
Анализ |
методы |
Эффективность 5'-кэпирования мРНК |
LC-MS после расщепления |
Процедура
Шаг 1. Разработка олигонуклеотидных шин (зондов)
Зонд расщепления, включающий 2'-O-метилнуклеотиды и тетрадезоксирибонуклеотиды, служит для расщепления комплементарной цепи РНК в определенных положениях, когда присутствует РНКаза H. Этот метод оказывается очень ценным для целенаправленной генерации более крупных фрагментов РНК.
Шаг 2. Расщепление РНКазой H
Биотинилированный зонд, стратегически разработанный так, чтобы быть комплементарным 5'-концу мРНК, применяется в сочетании с РНКазой H для катализа целевого расщепления 5'-конца олигонуклеотида, обладающего кэп-структурой.
Шаг 3. IP-RP-ВЭЖХ/ЖХ-МС
При анализе олигонуклеотидов методом ЖХ-МС предпочтительным хроматографическим режимом является разделение ионных пар в обращенной фазе (IP-RP) с использованием добавок аминной подвижной фазы. Это объясняется их превосходной разрешающей способностью и совместимостью с масс-спектрометрией (МС).
Шаг4. Анализ данных
Отчетливые массы, наблюдаемые во фрагментах расщепления с кэпом m7GpppG, в отличие от фрагментов с дифосфатным, трифосфатным или неметилированным G-кэпом (GpppG), облегчают их идентификацию и позволяют оценить эффективность кэпирования.
Случай анализа эффективности ограничения с помощью ЖХ-МС
Компания Yaohai-Bio Pharma разработала надежные методы анализа эффективности кэпирования мРНК: от конструкции олигонуклеотидных шин (зондов), расщепления РНКазой H, IP-RP-ВЭЖХ/ЖХ-МС до анализа данных.
Полные ионные хроматограммы (слева) и масс-спектры электроспрея (справа) 5'-концевых фрагментов расщепления.
EN
