Penyediaan IVT mRNA

Transkripsi in vitro (IVT) adalah kaedah utama untuk menyediakan mRNA, mampu menghasilkan mikrogram hingga miligram mRNA pada skala makmal. Untuk tujuan penyelidikan, pembekal bahan kimia telah membangunkan sistem tindak balas IVT yang fleksibel sesuai untuk mRNA panjang sederhana (1000-4000 nukleotida).

Dalam artikel ini, kami akan merangkumi transkripsi in vitro (IVT) mRNA, termasuk sistem tindak balas IVT konvensional yang digunakan pada skala makmal dan sistem tindak balas IVT yang sesuai untuk mRNA sangat panjang (>9000 nukleotida).

Kit membolehkan penutupan secara bersamaan dengan CleanCap AG dan mengurangkan imunogenik dengan m1ψ. DNase I mengeluarkan DNA sisa. Hasil rendah boleh disebabkan oleh pencampuran yang buruk, oksidasi bahan kimia, atau isu-isu templat DNA, yang boleh dikurangkan melalui sentrifugasi, bahan segar, kawalan, dan penyesuaian jumlah templat/masa tindak balas.

Yaohai Bio-Pharma menyediakan pelbagai produk IVT RNA terpragor (cairan/pulut beku) dan produk akhir LNP, yang mengandungi protein seperti protein bercahaya (eGFP, mCHERRY), luciferase, rekombinase Cre, dan antigen OVA, untuk memenuhi keperluan eksperimen atau projek yang berbeza.

Sistem IVT untuk mRNA Ultra-panjang

IVT biasa mungkin tidak berfungsi untuk mRNA yang terlalu panjang (>9000 nt). Kajian mendalam dan penyesuaian rasional komponen IVT diperlukan.

Templat DNA: Plasmid linear atau hasil PCR dengan urutan promotor sepadan, terlarut dalam H2O bebas RNase. Dikesyorkan konsentrasi templat DNA lebih tinggi daripada 40 nM untuk syarat IVT optimum.

DTT: Menjaga aktiviti enzim semasa transkripsi. DTT segar harus ditambahkan kepada buffer tindak balas untuk aktiviti enzim optimum.

Penyahister RNA: Menghalang aktiviti RNase dan menjaga kestabilan mRNA.

Polimerase RNA T7: Mencetuskan transkripsi DNA kepada RNA, yang sepadan dengan urutan promotor. Aktiviti polimerase RNA T7 dipengaruhi oleh pH dan ion magnesium.

Ion Magnesium (Mg2+): Sebatian kofaktor untuk polimerase RNA. Kadar yang terlalu rendah akan mengurangkan kecekapan transkripsi, manakala kadar yang terlalu tinggi boleh menyebabkan degradasi RNA. [Mg2+] bebas harus disesuaikan berdasarkan kepekatan nukleotida. Setiap nukleotida mengikat satu [Mg2+], jadi kepekatan [Mg2+] mestilah melebihi jumlah kepekatan nukleotida.

Nukleosida Trifosfat (NTP): Sebagai substrat, NTP adalah unit asas RNA. Kepekatan NTP di atas 7 mM mempunyai kesan positif terhadap pengeluaran mRNA.

Spermidin: Menstabilkan kompleks DNA-enzim dan merangsang tindak balas transkripsi; bagaimanapun, kadar yang berlebihan boleh memberi kesan penghalang. Kadar spermidin yang dicadangkan adalah antara 1 hingga 3 mM.

Pirofosfat Inorganik (PPase): Ditambahkan ke tindak balas IVT untuk mencegah penumpukan ion pirофosfat anorganik (PPi), mengelakkan pengikatan mereka dengan Mg2+ dan memastikan kandungan Mg2+ bebas yang mencukupi.

Dengan memanfaatkan teknologi terkini dan pengalaman mRNA IVT, Yaohai Bio-Pharma menawarkan perkhidmatan IVT RNA satu henti, merangkumi reka bentuk urutan, persediaan RNA IVT (dengan modifikasi m1ψ), siklisisasi RNA, pemurnian, penebatan, penyampulan LNP, dan ujian kualiti.

Kami juga aktif mencari rakan global institusi atau perorangan. Kami menawarkan ganti rugi paling kompetitif dalam industri ini. Jika anda ada sebarang soalan, sila rasa percuma untuk menghubungi kami: [email protected]