Penyediaan mRNA IVT

Transkripsi in vitro (IVT) ialah kaedah pilihan untuk menyediakan mRNA, yang mampu menghasilkan mikrogram kepada miligram mRNA pada skala makmal. Untuk tujuan penyelidikan, pembekal reagen telah membangunkan sistem tindak balas IVT serba boleh yang sesuai untuk mRNA panjang sederhana (1000-4000 nukleotida).

Dalam artikel ini, kami akan meringkaskan transkripsi in vitro (IVT) mRNA, termasuk sistem tindak balas IVT konvensional yang digunakan pada skala makmal dan sistem tindak balas IVT yang sesuai untuk mRNA ultra-panjang (> 9000 nukleotida).

Kit membolehkan pengehadan transkrip bersama dengan CleanCap AG dan mengurangkan imunogenisitas dengan m1ψ. DNase I membuang sisa DNA. Hasil yang rendah boleh disebabkan oleh masalah pencampuran yang lemah, pengoksidaan reagen atau templat DNA, yang boleh dikurangkan dengan sentrifugasi, reagen segar, kawalan dan melaraskan jumlah templat/masa tindak balas.

Yaohai Bio-Pharma menyediakan pelbagai produk IVT RNA pasang siap (cecair/serbuk kering beku) dan produk siap LNP, pengekodan protein seperti protein pendarfluor (eGFP, mCHERRY), luciferase, recombinase Cre dan antigen OVA, untuk memenuhi eksperimen atau projek yang berbeza keperluan.

Sistem IVT untuk mRNA Ultra-panjang

IVT konvensional mungkin tidak berfungsi untuk mRNA yang terlalu panjang (>9000 nt). Pemahaman yang mendalam dan pelarasan rasional komponen IVT diperlukan.

Templat DNA: Plasmid linear atau produk PCR dengan jujukan promoter yang sepadan, dilarutkan dalam H2O tanpa RNase. Kepekatan templat DNA yang lebih tinggi daripada 40 nM disyorkan untuk keadaan IVT yang optimum.

DTT: Mengekalkan aktiviti enzim semasa transkripsi. DTT segar perlu ditambah kepada penimbal tindak balas untuk aktiviti enzim yang optimum.

Perencat RNase: Menghalang aktiviti RNase dan mengekalkan kestabilan mRNA.

T7 RNA Polimerase: Memangkinkan transkripsi DNA kepada RNA, sepadan dengan jujukan promoter. Aktiviti polimerase RNA T7 dipengaruhi oleh ion pH dan magnesium.

Ion Magnesium (Mg2+): Kofaktor untuk RNA polimerase. Kepekatan terlalu rendah mengurangkan kecekapan transkripsi, manakala kepekatan terlalu tinggi membawa kepada degradasi RNA. Bebas [Mg2+] hendaklah dilaraskan berdasarkan kepekatan nukleotida. Setiap nukleotida mengelat satu [Mg2+], jadi kepekatan [Mg2+] harus melebihi jumlah kepekatan nukleotida.

Nukleosida Trifosfat (NTP): Sebagai substrat, NTP adalah unit asas RNA. Kepekatan NTP melebihi 7 mM mempunyai kesan positif terhadap pengeluaran mRNA.

Spermidin: Menstabilkan kompleks DNA-enzim dan merangsang tindak balas transkripsi; bagaimanapun, kepekatan berlebihan mempunyai kesan menghalang. Kepekatan spermidine yang disyorkan adalah antara 1 dan 3 mM.

Pyrophosphatase tak organik (PPase): Ditambah pada tindak balas IVT untuk mengelakkan pengumpulan ion pirofosfat tak organik (PPi), mengelakkan pengkelasinya dengan Mg2+ dan memastikan Mg2+ bebas yang mencukupi.

Memanfaatkan teknologi perintis dan pengalaman mRNA IVT, Yaohai Bio-Pharma menyediakan perkhidmatan RNA IVT sehenti, merangkumi reka bentuk jujukan, persediaan RNA IVT (dengan mod m1ψ), kitaran RNA, penulenan, pengeringan beku, enkapsulasi LNP dan ujian kualiti.

Kami juga sedang giat mencari rakan kongsi global institusi atau individu. Kami menawarkan pampasan yang paling kompetitif dalam industri. Jika anda mempunyai sebarang pertanyaan, sila hubungi kami: [email protected]