mRNS 3' poli(A) raksturojums
mRNS 3' poli(A) raksturojums
MRNS 3' poli(A) aste (poliadenozīni) ir neatņemama pēctranskripcijas regulējuma sastāvdaļa, ietekmējot mRNS eksportu, stabilitāti un translāciju. In vitro transkribētu (IVT) mRNS gadījumā poli (A) aste tiek ievadīta vai nu līdztranskripcijas laikā veidnē, vai ar enzīmu atdalīšanas procesu neveidnē. Šis 3′ poli(A) kalpo kā kritisks kvalitātes atribūts (CQA) IVT RNS, tādēļ ir nepieciešams rūpīgs raksturojums gan procesa izstrādes, gan sērijas izlaišanas laikā.
Yaohai Bio-Pharma nodrošina specializētus 3' poli(A) raksturošanas pakalpojumus, izmantojot tādas metodes kā ribonukleāzes T1 (RNase T1) šķelšana, jonu pāra apgrieztās fāzes augstas veiktspējas šķidruma hromatogrāfija (IP-RP-HPLC)/šķidruma hromatogrāfijas masas spektrometrija. (LC-MS) un visaptverošu datu analīzi.
Normatīvās prasības mRNS 3' poli(A) raksturojumam
Saskaņā ar PVO normatīvajiem apsvērumiem “mRNS struktūras integritāte tiek uzskatīta par kritisku kvalitātes atribūtu mRNS izdalīšanai. Tādējādi ir nepieciešama kontrole mRNS integritātei, 5′ ierobežojuma efektivitātei, 3′ poli(A) astes klātbūtnei vai garumam un tā tālāk.
Analītiskā metode
Analīze | Metodes |
mRNS 3' poli(A) raksturojums | LC-MS pēc gremošanas |
Procedūra
1. darbība. RNāzes T1 šķelšanās
Pilna garuma neskartas mRNS tieša analīze ar LC-MS ir nepraktiska tās lieluma un neviendabīguma dēļ. Lai pārbaudītu poli (A) asti, tā ir jāatdala no pilna garuma mRNS. Izplatītā metode ietver fermentatīvu šķelšanu ar RNase T1, selektīvi sadalot rG 3′ galu, vienlaikus saglabājot poli (A) secību. MRNS paraugs tiek sagremots ar RNase T1, un šķelšanās fragmenti, kas satur poli (A) posmus, tiek izolēti, izmantojot oligo dT pārklātas magnētiskās lodītes.
2. darbība. IP-RP-HPLC/LC-MS
Ekstrahētās astes tika analizētas, izmantojot LC-MS, piedāvājot precīzu informāciju par astes garumu ar viena nukleotīda izšķirtspēju. Oligonukleotīdu LC-MS analīzē vēlamais hromatogrāfijas režīms ir jonu pāru savienošanas apgrieztās fāzes (IP-RP) atdalīšana ar amīna mobilās fāzes piedevām, pateicoties to spēcīgajai izšķirtspējai un savietojamībai ar masas spektrometriju (MS).
3. solis. Datu analīze
Poli(A) astes garums un tā relatīvais daudzums ir atkarīgs no pīķu skaita un intensitātes, kas dalīta ar adenozīna masu. Apstrādājot vai dekonvolucionējot masu spektru, tiek noteikta paredzamā 100 mēru poli(A) astes masa (33,163 329 Da lodziņā), ko papildina masu sērija, kas izvietota ar XNUMX amu, kas ir līdzvērtīga adenozīna (A) masai. .
3' poli(A) raksturojums ar LC–MS
Yaohai-BioPharma ir izstrādājis spēcīgu metodi mRNS 3' poli(A) raksturošanai, ieskaitot RNāzes T1 šķelšanos un IP-RP-HPLC/LC-MS.
Yaohai-BioPharma ir izstrādājis spēcīgu metodi mRNS 3' poli(A) raksturošanai, ieskaitot RNāzes T1 šķelšanos un IP-RP-HPLC/LC-MS.
EN
