mRNS 5' aizbāžņa efektivitāte
mRNS 5' nosegšanas efektivitātes analīzes nozīme
Vāciņa struktūrai, kas atrodas mRNS 5′ galā, ir galvenā loma mRNS efektīvā translācijā, stabilizācijā un transportēšanā eikariotos. In vitro transkribētas (IVT) mRNS kontekstā 5' vāciņš tiek ievadīts, izmantojot vai nu kotranskripcijas ierobežošanas, vai fermentatīvās ierobežošanas procesus. Kā neaizstājams IVT RNS komponents, 5′ vāciņš ir kritisks kvalitātes atribūts (CQA), kas prasa visaptverošu raksturojumu procesa izstrādes un sērijas izlaišanas laikā.
Yaohai-Bio Pharma nodrošina visaptverošus 5' vāciņu efektivitātes analīzes risinājumus, kas ietver oligonukleotīdu šinu (zondes) dizainu, RNase H šķelšanu, IP-RP-jonu pāra apgrieztās fāzes augstas izšķirtspējas šķidruma hromatogrāfiju (IP-RP-HPLC)/šķidruma hromatogrāfiju. -masu spektrometrija (LC-MS), datu analīze.
Normatīvās prasības mRNS integritātei
Saskaņā ar PVO normatīvajiem apsvērumiem “mRNS struktūras integritāte tiek uzskatīta par kritisku kvalitātes atribūtu mRNS izdalīšanai. Tādējādi ir nepieciešama kontrole mRNS integritātei, 5′ ierobežojuma efektivitātei, 3′ poli(A) astes klātbūtnei vai garumam un tā tālāk.
Analītiskā metode
Analīze |
Metodes |
mRNS 5' aizbāžņa efektivitāte |
LC-MS pēc gremošanas |
Procedūra
1. solis. Oligonukleotīdu šinu (zondes) projektēšana
Šķelšanas zonde, kas ietver 2'-O-metilnukleotīdus un tetradeoksiribonukleotīdus, kalpo komplementāras RNS virknes šķelšanai noteiktās pozīcijās, kad ir klāt RNāze H. Šī metode izrādās ļoti vērtīga lielāku RNS fragmentu mērķtiecīgai ģenerēšanai.
2. solis. RNāzes H šķelšanās
Biotinilētu zondi, kas stratēģiski izstrādāta tā, lai tā būtu komplementāra ar mRNS 5' galu, tiek izmantota kopā ar RNāzi H, lai katalizētu mērķtiecīgu 5' gala oligonukleotīda, kam ir vāciņa struktūra, šķelšanos.
3. darbība. IP-RP-HPLC/LC-MS
Oligonukleotīdu LC-MS analīzē vēlamais hromatogrāfijas režīms ir apgrieztās fāzes (IP-RP) atdalīšana ar jonu pāriem, izmantojot amīna kustīgās fāzes piedevas. Tas ir saistīts ar to izcilo izšķirtspēju un savietojamību ar masas spektrometriju (MS).
4. darbība. Datu analīze
Atšķirīgas masas, kas novērotas šķelšanās fragmentos ar m7GpppG vāciņu, atšķirībā no tām, kurām ir difosfāts, trifosfāts vai nemetilēts G vāciņš (GpppG), atvieglo to identificēšanu un ļauj novērtēt ierobežošanas efektivitāti.
Ierobežošanas efektivitātes analīzes gadījums ar LC–MS
Yaohai-Bio Pharma ir izstrādājis spēcīgas metodes mRNS ierobežošanas efektivitātes analīzei, sākot no oligonukleotīdu šinu (zondes) dizaina, RNāzes H šķelšanas, IP-RP-HPLC/LC-MS līdz datu analīzei.
5' gala šķelšanās fragmentu kopējās jonu hromatogrammas (pa kreisi) un elektrosmidzināšanas masas spektri (pa labi)
EN
