Naudojant Fed-batch fermentacijos strategiją

Pichia pastoris yra plačiai naudojama įvairių heterologinių baltymų gamyboje. Aukštos ląstelių tankio fermentacijos (HCDF) technologija, įgyvendinama per Fed-Batch paruosimą, sėkmingai pasiekė biomedicininėms prekėms ir pramoniniams enzymams masinę gamybą. Tikslingai kontroliuojamoje seroje HCDF technologijos naudojimas gali užtikrinti aukštą grąžą, aukštą veiklą ir ekonomiškus rekombinantus baltmenus.

Naujausi tyrimai rodo, kad HCDF strategijomis siekiama padidinti heterologinių baltymų gamybą ir jų veiklą Pichia pastoris. HCDF technologija leidžia lengvai pasiekti aukštą ląstelių koncentraciją apibrėžtyje seroje, todėl galima gauti daug rekombinantų baltmenų su pagerinta veikla ir mažesniais išlaidais naudojant HCDF. Tačiau tinkamos HCDF strategijos pasirinkimas, siekiant optimizuoti aukštą tam tikrų baltmenų išraišką Pichia pastoris, vis dar yra iššūkis.

Aukštos ląstelių tankio fermentacija (HCDF)

Pichia pastoris išskiriasi heterologinio proteino gamyboje, ypač vertinama HCDF automatinėse bioreaktoriuose. HCDF turi 3 etapus: glicerolo serija, pardavimas ir metanolinis indukcija. Yaohai Bio-Pharma gali pasiteisinti daugiau nei dešimtmečiu mikroorganizmų fermentacijos patirties ir jau įvykdžio daugiau nei 400 projektų. Įmonė turi plačią ekspertizę ir gerai išsivystusias technologijas, kurios leidžia naudoti įvairias HCDF strategijas, siekiant pagerinti proteino gamybos efektyvumą.

Metanolis vaidina dvigubą vaidmenį – kaip AOX1 induktorius ir anglies šaltinis, tačiau jo koncentracija turi būti kontroliuojama, kad išvengti toksiškumo. Įvertinant skirtingas metanolinių pardavimo strategijas yra būtina optimizuoti Pichia pastoris augimą ir proteino išraišką.

Metanolinė indukcijos strategija

Fed-batch HCDF metanolą indukcijos strategijoje, būsenos pagrįstos indukcijos strategijos apima kontrolės metodikų rinkinį, kuris reguliuoja priedinių metanolų pridėjimą per internetinę/arba neinternetinę arba pirmyn/atgal kontrolę. Tarp statistinių indukcijos strategijų pagrindinės yra μ-stat, Išspręstasis Deguonis (DO)-stat, metanolą-stat ir biomasės-stat.

1.1 μ-stat

μ-stat strategija laiko biomasę stabilia kontroliuojant μ, padedant reprodukuotumui ir tyrinėdama μ poveikį baltymų išraiškai. Tačiau ji trūksta tiesioginio metanolų ir DO valdymo, kovokiant riziką akumuliavimuisi ir ROS generavimui.

1.2 DO-stat

DO-stat strategija netiesiogiai reguliuoja metanolą, valdant išsisklaidusius deguonies dujus, kad palaikytų oksigenaciją, tačiau ji nesuteikia fiksuoto metanolo koncentracijos ir augimo tempio, kuriuos tai gali paveikti studijuojant baltymų išraišką. Oksigenacija yra iššūkis aerobinėje fermentacijoje, ir nors šilties dujų papildymas gali būti brangus ir toksinis, slėgio padidinimas yra ekonomiškesnis požiūris, kuris taip pat gali pagerinti baltymų aktyvumą.

1.3 Metanol-stat

Nepakankamas metanolo koncentracijos valdymas riboja abi μ-stat ir DO-stat strategijas. Metanol statistinės strategijos, veikiančios ant/įjungimo režimu, yra nepastovios ir trūksta tikslumo. Priešingai, PID reguliatoriai siūlo tikslesnį metanolo koncentracijos valdymą, kuris gerina bendrą fermentacijos efektyvumą.

1.4 Biomasa-stat

Biomase-stat strategija apibrėžia ryšį tarp biomases ir metanolų pateikimo, optimizuodama metanolų pateikimo spartą, kad būtų padidintas baltymų grąžinys. Biomases tikrinimas tiesiogiai yra praktiškesnis, o kaip pagrindinis metodas naudojamas srovės citometras. 1000L mastu, metanolų pateikimo sparta yra esencialiai pagerinta, tai gerina enzymo aktyvumą, grąžinį ir produktyvumą, viršijant stiklinių butelių fermentaciją.

Kopinio pateikimo strategija

Glicerolis, kaip AOX1 promotoriaus inhibitorius, turi būti pilnai suvartotas prieš metanolų indukciją, kad išvengti baltymų gamybos sulėtinimo. Kopiniai substratai gali stiprinti enzymo aktyvumą, tačiau per daug glicerolio gali žalauti augimą ir reiškimą. Sorbitolas, askorbiniar kislota, manitolis ir kitieji gali pakeisti glicerolį, sumažindami proteolizą ir audinimo laiką, bei stiprindami baltymų reiškimą.

Genų bankas reikalauja priimti tinkamas saugojimo metodus ir esamą aplinką, kad būtų palaikoma genų savybių stabilumas. Yaohai Bio-Pharma gali atitikti reikalavimus gliserolo saugojimo (naudojant ultramažus šaldymo šaldytuvus ar skystąją anglį) ir kvasinio grybų bei E. coli lyophilizacijos reikmenims.

Ribojamojo veiksnio strategija

Pichia pastoris organizme ribojamosios sąlygos, tokios kaip mažas DO, metanolio koncentracija ir deguonies apribojimas, skatina rekombinantinių baltymų išraišką. Deguonies apribojimas aktyvuoja AOX1 promotorių per metanolio akumuliavimą, padidindamas baltymų gamybą ir sumažindamas šilumą. Mažos temperatūros indukcija pagerina gręžes, aktyvumą, stabilumą ir ląstelių gyvybingumą, tačiau didina šaldymo išlaidas. pH ir azoto apribojimas taip pat prisideda prie išraiškos, reikalaujant dėmesio, kad būtų išvengta techninių problemų. Azoto apribojimas ypač geria produktyvumą.

Yaohai Bio-Pharma taip pat aktyviai ieško visuotinių partnerių, institucijų ar asmenų, ir siūlo geresnį nei konkurentai atlygį šioje srityje. Jei turite klausimų, prašome ją kreiptis: [email protected]