Låsa upp hemligheterna med högkvalitativ plasmidextraktion

Plasmidextraktion är avgörande för forskare. Som genvektorer är plasmider avgörande i vaccinforskning och genterapi, där kvaliteten är avgörande. Viktiga kvalitetsfaktorer inkluderar supercoiled proportion och endotoxinhalt. Reglerna varierar: FDA ≥80 %, SMPA ≥85 %, NMPA ≥90 %, med <5 % linjärt/öppet cirkulärt DNA. Kunder föredrar ofta ≥95 % supercoiled. Endotoxinnivåer är: forskning (>50 EU/µg), transfektion (<50 EU/µg) och endotoxinfri (<0.1 EU/µg).

Supercoiled plasmid-DNA

Plasmider från Escherichia coli inkluderar supercoiled (SC), öppen-cirkulär (OC) och linjär (L) DNA. Hög SC-andel ökar transfektionseffektiviteten och uttrycket. Till exempel är en 85.45% SC-plasmids transfektion 2.5x högre, och en 93.28% SC-plasmids HGF-uttryck är 1.8x högre, vilket bekräftar SC-DNA:s överlägsenhet.

Öppet cirkulärt DNA: När en sträng av dubbelsträngat DNA går sönder lossnar den superlindade strukturen och bildar en öppen cirkulär plasmid med en större volym som migrerar långsammast under elektrofores och är placerad på toppen.

Linjärt DNA: När båda strängarna av plasmid-DNA går sönder bildas en linjär struktur, med en relativt mindre volym som migrerar snabbare än öppen-cirkulär DNA men långsammare än superspiral-DNA, placerad på andra plats.

Supercoiled DNA: Två helixar flätas samman, vrider sig till en supercoiled struktur baserad på DNA-helixen. Den har den minsta volymen och migrerar snabbast under elektrofores, placerad i botten.

Kvantitativ analys av Supercoiled Proportion

Labs använder agarosgelelektrofores (AGE) och Gel-Pro Analyzer för att bedöma supercoiled proportion via elektroforesbilder. En bild visar 97.539 % SC DNA, medan en annan visar 63.833 % SC och 36.167 % OC DNA (linjärt DNA syns inte).

Hemligheten med endotoxin i plasmider

Endotoxin är en komponent i det yttre lagret av cellväggen hos gramnegativa bakterier, frisatt efter bakteriedöd eller lysering, innehållande giftig lipopolysackarid A. Under plasmidextraktion kommer endotoxin in i lyslösningen, vilket påverkar transfektionseffektiviteten och utlöser ospecifika immunsvar, vilket leder till till falska positiva i experiment.

Kvantitativ och kvalitativ analys av endotoxin

Limulus amebocytlysat (LAL)-testet detekterar endotoxin via agglutination med 2-keto-3-deoxioktonsyra (KDO) i lipopolysackariden (LPS). Det är kvalitativt och semikvantitativt, vilket indikerar närvaro av endotoxiner genom koagulering eller färgförändring när den blandas med prover.

Yaohai Bio-Pharma erbjuder endotoxinfria supercoiled plasmider. Outsourcing till Yaohai ökar transfektion och uttryckseffektivitet. Levererade plasmider har en ≥95% SC-andel (genomsnitt 85%±10%) och endotoxinnivåer ≤0.1, ≤0.01 eller ≤0.005 EU/μg.

Vi söker också aktivt institutionella eller individuella globala partners. Vi erbjuder den mest konkurrenskraftiga ersättningen i branschen. Om du har några frågor är du välkommen att kontakta oss: [email protected]