IVT-mRNA-beredning

In vitro-transkription (IVT) är den föredragna metoden för att framställa mRNA, som kan ge mikrogram till milligram mRNA i laboratorieskala. För forskningsändamål har reagensleverantörer utvecklat mångsidiga IVT-reaktionssystem lämpliga för mRNA av måttlig längd (1000-4000 nukleotider).

I den här artikeln kommer vi att sammanfatta in vitro-transkription (IVT) av mRNA, inklusive det konventionella IVT-reaktionssystemet som används i laboratorieskala och IVT-reaktionssystemet lämpligt för ultralångt mRNA (>9000 nukleotider).

Kit möjliggör co-transkriptionell kapning med CleanCap AG och minskar immunogeniciteten med m1ψ. DNas I tar bort kvarvarande DNA. Lågt utbyte kan bero på dålig blandning, reagensoxidation eller problem med DNA-mall, vilket kan mildras genom centrifugering, färska reagenser, kontroller och justering av mallmängd/reaktionstid.

Yaohai Bio-Pharma tillhandahåller olika prefabricerade IVT RNA-produkter (vätske/frystorkat pulver) och LNP-färdiga produkter, som kodar för proteiner som fluorescerande proteiner (eGFP, mCHERRY), luciferas, rekombinas Cre och antigen OVA, för att möta olika experimentella eller projekt behov.

IVT-system för ultralångt mRNA

Konventionell IVT kanske inte fungerar för alltför långt mRNA (>9000 nt). En djup förståelse och rationell anpassning av IVT-komponenter behövs.

DNA-mall: Linjäriserade plasmider eller PCR-produkter med motsvarande promotorsekvenser, lösta i RNas-fritt H2O. En DNA-mallkoncentration högre än 40 nM rekommenderas för optimala IVT-förhållanden.

DTT: Upprätthåller enzymaktivitet under transkription. Färsk DTT bör tillsättas till reaktionsbufferten för optimal enzymaktivitet.

RNas-hämmare: Hämmar RNas-aktivitet och upprätthåller mRNA-stabilitet.

T7 RNA polymeras: Katalyserar DNA-transkription till RNA, motsvarande promotorsekvensen. Aktiviteten hos T7 RNA-polymeras påverkas av pH och magnesiumjoner.

Magnesiumjoner (Mg2+): En kofaktor för RNA-polymeras. För låga koncentrationer minskar transkriptionseffektiviteten, medan för höga koncentrationer leder till RNA-nedbrytning. Fri [Mg2+] bör justeras baserat på nukleotidkoncentration. Varje nukleotid kelerar en [Mg2+], så [Mg2+]-koncentrationen bör överstiga den totala nukleotidkoncentrationen.

Nukleosidtrifosfater (NTP): Som substrat är NTP:er de grundläggande enheterna av RNA. NTP-koncentrationer över 7 mM har en positiv inverkan på mRNA-produktionen.

Spermidin: Stabiliserar DNA-enzymkomplex och stimulerar transkriptionsreaktioner; överdrivna koncentrationer har dock hämmande effekter. Den rekommenderade spermidinkoncentrationen är mellan 1 och 3 mM.

Oorganiskt pyrofosfatas (PPas): Läggs till IVT-reaktioner för att förhindra ackumulering av oorganiska pyrofosfatjoner (PPi), för att undvika deras kelatbildning med Mg2+ och säkerställa tillräckligt med fritt Mg2+.

Med hjälp av banbrytande teknologi och IVT mRNA-erfarenhet tillhandahåller Yaohai Bio-Pharma en enda IVT RNA-tjänst, som omfattar sekvensdesign, IVT RNA-prep (med m1ψ-mods), RNA-cyklisering, rening, frystorkning, LNP-inkapsling och kvalitetstestning.

Vi söker också aktivt institutionella eller individuella globala partners. Vi erbjuder den mest konkurrenskraftiga ersättningen i branschen. Om du har några frågor är du välkommen att kontakta oss: [email protected]