IVT mRNA-förberedelse

In vitro-transkription (IVT) är den föredragna metoden för att förbereda mRNA, vilket kan ge mikrogram till milligram mRNA på laboratorie-skala. För forskningsändamål har leverantörer av reagens utvecklat flexibla IVT-reaktionssystem som är lämpliga för mRNA av moderat längd (1000-4000 nukleotider).

I denna artikel sammanfattar vi in vitro-transkription (IVT) av mRNA, inklusive det konventionella IVT-reaktionssystemet som används på laboratorie-skala och det IVT-reaktionssystem som är lämpligt för ultra-lång mRNA (>9000 nukleotider).

Kiten möjliggör ko-transkriptionell kapning med CleanCap AG och minskar immunogeniteten med m1ψ. DNase I tar bort residuellt DNA. Låg utbyte kan orsakas av otillräcklig blandning, oxidering av reagens eller problem med DNA-mallen, vilket kan åtgärdas genom centrifugerade, friska reagenser, kontroller och justering av mallmängd/reaktionstid.

Yaohai Bio-Pharma erbjuder olika förhandsfabrikade IVT RNA-produkter (vätska/frysförvarad pudder) och LNP-färdiga produkter, som kodar för proteiner såsom fluorescerande proteiner (eGFP, mCHERRY), luciferase, rekombinase Cre och antigen OVA, för att uppfylla olika experimentella eller projektbehov.

IVT-system för ultralång mRNA

Konventionell IVT kanske inte fungerar för överdrivet lång mRNA (>9000 nt). En djupgående förståelse och rationell justering av IVT-komponenterna krävs.

DNA-mall: Lineariserade plasmider eller PCR-produkter med motsvarande promotorsekvenser, upplösta i RNase-fritt H2O. En DNA-mallkonsentration högre än 40 nM rekommenderas för optimala IVT-villkor.

DTT: Upprätthåller enzymaktivitet under transkriptionen. Friskt DTT bör läggas till i reaktionsbufferten för optimal enzymaktivitet.

RNase-inhibitor: Inhiberar RNase-aktivitet och upprätthåller mRNA-stabiliteten.

T7 RNA-polymeras: Katalyserar DNA-transkription till RNA, vilket motsvarar promotersekvensen. Aktiviteten av T7 RNA-polymeras påverkas av pH och magnesiumioner.

Magnesiumioner (Mg2+): En cofaktor för RNA-polymeras. För låga koncentrationer minskar transkriptionseffektiviteten, medan för höga koncentrationer leder till RNA-degradering. Fri [Mg2+] bör justeras utifrån nukleotidkoncentrationen. Varje nukleotid binder en [Mg2+], så [Mg2+] koncentrationen bör överstiga den totala nukleotidkoncentrationen.

Nukleosidtrifosfat (NTP): Som substrat är NTP:er de grundläggande byggstenarna i RNA. NTP-koncentrationer över 7 mM har en positiv effekt på mRNA-produktionen.

Spermidin: Stabiliserar DNA-enzymkomplexerna och stimulerar transkriptionsreaktioner; dock har övermåliga koncentrationer inhiberande effekter. Den rekommenderade spermidinkoncentrationen ligger mellan 1 och 3 mM.

Inorganisk pyrofosfatase (PPase): Tillagt i IVT-reaktionerna för att förhindra ackumuleringen av inorganiska pyrofosfatjoner (PPi), undviker deras komplexbildning med Mg2+ och säkerställer tillräckligt med fri Mg2+.

Genom att utnyttja pioneerande teknik och erfarenhet från IVT mRNA erbjuder Yaohai Bio-Pharma en totaltjänst för IVT RNA, som omfattar sekvensdesign, IVT RNA-förberedelse (med m1ψ-modifikationer), RNA-cykling, reningsprocess, frysförvaring, LNP inkapsling och kvalitetstestning.

Vi söker också aktivt globala partnerschaft med institutioner eller enskilda personer. Vi erbjuder den mest konkurrenskraftiga ersättningen inom branschen. Om du har några frågor, tveka inte att kontakta oss: [email protected]