Utnyttja kraften i Fed-batchfermenteringsstrategin

Pichia pastoris används i stor utsträckning vid produktion av olika heterologa proteiner. High-Cell-Density Fermentation (HCDF)-teknologin, implementerad genom Fed-Batch-matning, har framgångsrikt uppnått storskalig produktion av bioläkemedel och industriella enzymer. I exakt kontrollerade medier kan användningen av HCDF-teknologi erhålla högutbyte, högaktivitet och kostnadseffektiva rekombinanta proteiner.

Ny forskning tyder på att genom HCDF-strategier görs ansträngningar för att öka produktionen och aktiviteten av heterologa proteiner i Pichia pastoris. HCDF-teknologi möjliggör enkel uppnående av högnivåcellkluster i definierade media, vilket möjliggör förvärvet av rikligt med rekombinanta proteiner med ökad aktivitet och minskade kostnader genom HCDF. Att välja den lämpliga HCDF-strategin för att optimera uttrycket på hög nivå av specifika proteiner i Pichia pastoris är dock fortfarande en utmaning.

High-Cell-Density Fermentation (HCDF)

Pichia pastoris utmärker sig i heterolog proteinproduktion, favoriserad för HCDF i automatiserade bioreaktorer. HCDF har 3 steg: glycerolbatch, utfodring och metanolinduktion. Yaohai Bio-Pharma har över ett decenniums erfarenhet av mikrobiell fermentering och har betjänat över 400 projekt. Bolaget besitter omfattande kompetens och välutvecklad teknologi, vilket gör det möjligt att använda olika HCDF-strategier för att effektivisera proteinproduktionen.

Metanol fungerar både som en inducerare av AOX1 och en kolkälla, men dess koncentration måste kontrolleras för att förhindra toxicitet. Att utvärdera olika metanolmatningsstrategier är avgörande för att optimera tillväxten av Pichia pastoris och proteinuttryck

Metanolinduktionsstrategi

I Fed-batch HCDF-metanolinduktionsstrategin omfattar statliga induktionsstrategier en uppsättning kontrollmetoder som reglerar den extra tillsatsen av metanol genom online/offline eller framåt/bakåt kontroll. Bland de statistiska induktionsstrategierna inkluderar de viktigaste μ-stat, löst syre (DO)-stat, metanol-stat och biomassa-stat.

1.1 μ-stat

μ-statstrategin håller biomassan stabil genom att kontrollera μ, hjälpa reproducerbarheten och studera μs effekt på proteinuttryck. Den saknar dock direkt metanol- och DO-kontroll, vilket riskerar ackumulering och ROS-generering.

1.2 DO-stat

DO-statstrategin reglerar indirekt metanolmatningen genom att kontrollera det lösta syret för att upprätthålla syresättningen, men den fixerar inte metanolkoncentrationen och tillväxthastigheten, vilket kan påverka studiet av proteinuttryck. Syresättning utgör en utmaning vid aerob jäsning, och även om tillskott av rent syre kan vara kostsamt och giftigt, är tryckhöjning ett mer ekonomiskt tillvägagångssätt som också kan förbättra proteinaktiviteten.

1.3 Metanol-stat

Otillräcklig kontroll av metanolkoncentrationen innebär begränsningar för både μ-stat och DO-stat strategier. Metanolstatistiska strategier, som fungerar i ett på/av-läge, är benägna att fluktuera och saknar precision. Däremot erbjuder PID-regulatorer en mer exakt reglering av metanolkoncentrationen, vilket förbättrar den totala jäsningseffektiviteten.

1.4 Biomassa-stat

Biomassa-statstrategin definierar förhållandet mellan biomassa och metanolmatning, och optimerar metanolinmatningshastigheten för att öka proteinutbytet. Onlineövervakning av biomassa är mer praktiskt, med flödescytometri som den föredragna metoden. I en 1000L-skala förbättrar optimering av metanolmatningshastigheten enzymaktiviteten, avkastningen och produktiviteten avsevärt, vilket överträffar kolvens jäsning.

Sammatningsstrategi

Glycerol, som en AOX1-promotorhämmare, måste konsumeras helt innan metanolinduktion för att undvika att undertrycka proteinproduktion. Samsubstrat kan öka enzymaktiviteten men överskott av glycerol kan skada tillväxt och uttryck. Sorbitol, askorbinsyra, mannitol och andra kan ersätta glycerol, vilket minskar proteolys och odlingstid och förbättrar proteinuttryck.

Stambanken kräver att man använder lämpliga konserveringsmetoder och placeras i en lämplig miljö för att bibehålla stabiliteten hos stamegenskaperna. Yaohai Bio-Pharma kan uppfylla kraven för konservering av glycerollager (via frysar med ultralåg temperatur eller flytande kväve) och frystorkning av jäst och E. coli.

Restriktionsinducerad strategi

I Pichia pastoris ökar restriktiva förhållanden som låg DO, metanolkoncentration och syregräns rekombinant proteinuttryck. Syrebegränsade förhållanden aktiverar AOX1-promotorn via metanolackumulering, vilket ökar proteinproduktionen samtidigt som värmen reduceras. Lågtemperaturinduktion förbättrar utbyte, aktivitet, stabilitet och cellviabilitet men lägger till kylningskostnader. pH- och kvävebegränsning underlättar också uttrycket, vilket kräver försiktighet för att undvika driftsproblem. Kvävebegränsning ökar särskilt specifik proteinproduktivitet.

Yaohai Bio-Pharma söker också aktivt efter institutionella eller individuella globala partners och erbjuder den mest konkurrenskraftiga ersättningen i branschen. Om du har några frågor är du välkommen att kontakta oss: [email protected]