Att utnyttja kraften i Fed-batch fermenteringsstrategin

Pichia pastoris används allmänt i produktionen av olika heterologa proteiner. High-Cell-Density Fermentation (HCDF)-tekniken, implementerad genom Fed-Batch-näringsinmatning, har lyckats uppnå storskalig produktion av biomedicinska produkter och industriella enzym. I noggrant kontrollerade medium kan användningen av HCDF-tekniken få fram höguppgiftiga, högaktivitets- och kostnadseffektiva rekombinanta proteiner.

Senaste forskningen visar att genom HCDF-strategier görs försök för att öka produktionen och aktiviteten av heterologa proteiner i Pichia pastoris. HCDF-tekniken möjliggör enkelt uppnående av högnivå cellkluster i definierade medier, vilket gör det möjligt att få tillgång till omfattande mängder rekombinanta proteiner med förbättrad aktivitet och minskade kostnader via HCDF. Dock är valet av lämplig HCDF-strategi för att optimera högnivåuttrycket av specifika proteiner i Pichia pastoris fortfarande en utmaning.

High-Cell-Density Fermentation (HCDF)

Pichia pastoris är utmärkt inom framställning av heterologa proteiner och används ofta för HCDF i automatiserade bioreaktorer. HCDF har tre faser: glyceroltillförsel, födosage och methanolinduktion. Yaohai Bio-Pharma har mer än ett decenniums erfarenhet inom mikrobiell fermetering och har arbetat med över 400 projekt. Företaget har omfattande expertis och välutvecklad teknik, vilket gör det möjligt att använda olika HCDF-strategier för att förbättra effektiviteten i proteinförädling.

Methanol fungerar som både inducerare av AOX1 och koldioxidkälla, men dess koncentration måste kontrolleras för att förhindra toksicitet. Att utvärdera olika strategier för methanolfödosage är avgörande för att optimera tillväxten hos Pichia pastoris och proteinetablering.

Strategi för methanolinduktion

I fed-batch HCDF-metanolinduceringsstrategin omfattar tillståndsbaserade induceringsmetoder en uppsättning kontrollmetodiker som reglerar den tilläggsmässiga tillförseln av metanol via online/offline eller framåt/bakåtkontroll. Bland de statistiska induceringsmetoderna inkluderar de huvudsakliga μ-stat, Dissolved Oxygen (DO)-stat, metanol-stat och biomass-stat.

1.1 μ-stat

μ-stat-strategin håller biomassen stadig genom att kontrollera μ, vilket bidrar till reproducerbarhet och studier av μ:s effekt på proteinet uttryck. Dock saknas direktkontroll av metanol och DO, vilket kan leda till ackumulering och ROS-produktion.

1.2 DO-stat

DO-stat-strategin reglerar indirekt metanolförsörjningen genom att kontrollera den upplösta syret för att bibehålla syring, men den fastställer inte metanolkoncentrationen och växtraten, vilket kan påverka studien av proteinet uttryck. Syring utgör en utmaning vid aerob fermentering, och även om tillförseln av rent syre kan vara kostsam och toksisk är tryckförstärkning en mer ekonomisk metod som också kan förbättra proteinkoncentrationen.

1.3 Methanol-stat

Otillräcklig kontroll av metanolkoncentrationen ställer begränsningar för både μ-stat- och DO-stat-strategier. Metanolstatistiska strategier, som fungerar i ett på/av-läge, är benägna till svängningar och lacksak noggrannhet. I kontrast till detta erbjuder PID-reglagare en mer preciserande reglering av metanolkoncentrationen, vilket förbättrar den totala effektiviteten i fermenteringen.

1.4 Biomass-stat

Biomass-stat-strategin definierar relationen mellan biomassa och metanolnäring, genom att optimera metanolnäringstakten för att förbättra proteinyield. Onlineövervakning av biomassen är mer praktiskt, med flödescytometri som den föredragna metoden. På en 1000L-skala förbättrar optimeringen av metanolnäringstakten avsevärt enzymaktivitet, yield och produktivitet, vilket överträffar flaskfermentering.

Samtidig näringstrategi

Glycerol, som en AOX1-promotorhämtningsmedel, måste vara fullständigt förbrukat innan metanolinduktionen för att undvika att supressera proteinkonstruktionen. Samtidiga substrat kan förbättra enzymaktiviteten men övermåttlig glycerol kan skada tillväxt och expression. Sorbitol, askorbinsyra, mannitol och andra kan ersätta glycerol, vilket minskar proteolyser och odetid samt förbättrar proteinkonstruktionen.

Strainbanken kräver att lämpliga bevaringsmetoder antas och placering i en lämplig miljö för att bibehålla stabiliteten i strandegenskaperna. Yaohai Bio-Pharma kan uppfylla kraven för bevaring av glycerollager (via ultralågtemperatured freezer eller vätskekväve) och frysdjurbevaring av jäs och E. coli.

Restriktion-inducerad strategi

I Pichia pastoris ökar restriktiva villkor som låg DO, metanolkoncentration och syresnåighet rekombinant proteinetablering. Syresnåiga villkor aktiverar AOX1-promotor via ackumulering av metanol, vilket höjer proteinkvaliteten samtidigt som värme minskas. Lågtemperaturinduktion förbättrar utbyte, aktivitet, stabilitet och cellvitalitet men med tillägg av kylkostnader. pH och kvävedrabbning stöder också expressionen, med försiktighet för att undvika operativa problem. Kvädedrabbning förstärker märkbart specifik proteintillverkning.

Yaohai Bio-Pharma söker också aktivt efter globala partner, både institutioner och enskilda personer, och erbjuder den mest konkurrenskraftiga ersättningen i branschen. Om du har några frågor, tveka inte att kontakta oss: [email protected]