Prepararea ARNm IVT

Transcripția in vitro (IVT) este metoda preferată pentru prepararea ARNm, capabilă să producă micrograme până la miligrame de ARNm la scară de laborator. În scopuri de cercetare, furnizorii de reactivi au dezvoltat sisteme de reacție IVT versatile potrivite pentru ARNm de lungime moderată (1000-4000 de nucleotide).

În acest articol, vom rezuma transcripția in vitro (IVT) a ARNm, inclusiv sistemul de reacție IVT convențional utilizat la scară de laborator și sistemul de reacție IVT potrivit pentru ARNm ultra-lung (>9000 de nucleotide).

Kiturile permit limitarea co-transcripțională cu CleanCap AG și reduc imunogenitatea cu m1ψ. ADNza I elimină ADN rezidual. Randamentul scăzut se poate datora amestecării slabe, oxidarii reactivilor sau problemelor șablonului ADN, care pot fi atenuate prin centrifugare, reactivi proaspeți, controale și ajustarea cantității de șablon/timp de reacție.

Yaohai Bio-Pharma furnizează diverse produse prefabricate IVT ARN (lichid/pulbere liofilizată) și produse finite LNP, care codifică proteine ​​precum proteine ​​fluorescente (eGFP, mCHERRY), luciferaza, recombinaza Cre și antigenul OVA, pentru a satisface diferite experimente sau proiecte. nevoi.

Sistem IVT pentru ARNm ultralung

IVT convențional poate să nu funcționeze pentru ARNm prea lung (>9000 nt). Sunt necesare o înțelegere profundă și o ajustare rațională a componentelor IVT.

Șablon ADN: Plasmide liniarizate sau produse PCR cu secvențe promotoare corespunzătoare, dizolvate în H2O fără RNază. O concentrație de șablon ADN mai mare de 40 nM este recomandată pentru condiții optime de IVT.

DTT: Menține activitatea enzimatică în timpul transcripției. DTT proaspăt ar trebui adăugat la tamponul de reacție pentru o activitate enzimatică optimă.

Inhibitor de RNază: Inhibă activitatea RNazei și menține stabilitatea ARNm.

ARN polimeraza T7: Catalizează transcripția ADN-ului în ARN, corespunzătoare secvenței promotorului. Activitatea ARN polimerazei T7 este afectată de pH și ionii de magneziu.

Ioni de magneziu (Mg2+): Un cofactor pentru ARN polimerază. Concentrațiile prea scăzute reduc eficiența transcripției, în timp ce concentrațiile prea mari duc la degradarea ARN. [Mg2+] liber trebuie ajustat în funcție de concentrația de nucleotide. Fiecare nucleotidă chelează câte un [Mg2+], astfel încât concentrația de [Mg2+] ar trebui să depășească concentrația totală de nucleotide.

Trifosfați nucleozidici (NTP): Ca substraturi, NTP-urile sunt unitățile de bază ale ARN. Concentrațiile de NTP peste 7 mM au un impact pozitiv asupra producției de ARNm.

Spermidină: Stabilizează complexele ADN-enzimă și stimulează reacțiile de transcripție; totuși, concentrațiile excesive au efecte inhibitoare. Concentrația recomandată de spermidină este între 1 și 3 mM.

Pirofosfataza anorganică (PPază): Adăugat la reacțiile IVT pentru a preveni acumularea ionilor anorganici de pirofosfat (PPi), evitând chelarea acestora cu Mg2+ și asigurând suficient Mg2+ liber.

Folosind tehnologia de pionierat și experiența ARNm IVT, Yaohai Bio-Pharma oferă un serviciu unic de ARN IVT, care cuprinde proiectarea secvenței, pregătirea ARN IVT (cu mod-uri m1ψ), ciclizarea ARN, purificarea, liofilizarea, încapsularea LNP și testarea calității.

De asemenea, căutăm în mod activ parteneri instituționali sau individuali la nivel mondial. Oferim cea mai competitivă compensație din industrie. Dacă aveți întrebări, vă rugăm să nu ezitați să ne contactați: [email protected]