IVT mRNA paruošimas

In vitro transkripcija (IVT) yra pirmenybės metodas mRNA gamybai, kuris gali suteikti mikrogramus iki miligramų mRNA laboratorinėje apimtyje. Tyrimams reagentų tiekėjai sukūrė daugiafunkcinius IVT reakcijos sistemų, tinkančius vidutinio ilgio (1000-4000 nukleotidai) mRNA gaminti.

Šiame straipsnyje mes sumariuosime in vitro transkripciją (IVT) mRNA, įskaitant tradicinę IVT reakcijos sistemą, naudojamą laboratorinėje apimtyje, bei IVT reakcijos sistemą, tinkančią superilgoms mRNA (>9000 nukleotidai).

Rinkiniai leidžia atlikti ko-transkripcinį apdorojimą su CleanCap AG ir sumažinti imunogeniškumą naudojant m1ψ. DNase I pašalina likusį DNA. Mažas produktaujimas gali būti dėl netinkamos maišos, reagentų oksidacijos ar DNA šablonų problemų, kurių galima išvengti centrifugavimu, naujaisiais reagentais, kontrolėmis ir reguliuojant šablono kiekį/reakcijos laiką.

Yaohai Bio-Pharma siūlo įvairius iš anksto pagamintus IVT RNA produktus (dydžio arba šilto uždangos pavidalu) ir LNP galutinius produktus, kuriuose koduojami tokie baltymai kaip fluorescenciniai baltymai (eGFP, mCHERRY), luciferazas, rekombinazas Cre ir antigenas OVA, kad būtų tenkiniama skirtingų eksperimentų ar projektų poreikiai.

Sistemos ultra-ilgiems mRNA

Įprasta IVT gali neveikti per ilgoms mRNA (>9000 nt). Reikalingas giliąs supratimas ir racionalus IVT komponentų reguliavimas.

DNA šablonas: Linijinė plazmidų ar PCR produktų su atitinkamais promotorinių sekų elementais, išspręstų RNase-free H2O. Rekomenduojama naudoti DNA šabloną, kurio koncentracija yra aukštesnė nei 40 nM, kad būtų pasiektos optimalios IVT sąlygos.

DTT: Palaiko enzymo aktyvumą per transkripciją. Optimalaus enzymo aktyvaus veikimo siekiant, reikia pridėti naują DTT į reakcijos buferį.

RNase inhibitorius: Inhibuoja RNase aktyvumą ir palaiko mRNA stabilumą.

T7 RNA polimerazė: Katalizuojantis DNA transkripciją į RNA, atitinkančią promotoriaus seką. T7 RNA polimerazos veikla priklauso nuo pH ir magnio ionų.

Magnio jonai (Mg2+): RNA polimerazos koefactorius. Per maži koncentracijos lygiai sumažina transkripcijos efektyvumą, o per dideli koncentracijos lygiai gali sukelti RNA degimo procesą. Laisvojo [Mg2+] lygis turėtų būti sutvarkytas pagal nukleotidų koncentraciją. Kiekviename nukleotide susijęs vienas [Mg2+], todėl [Mg2+] koncentracija turėtų viršyti bendrąjį nukleotidų koncentraciją.

Nukleozidiniai trifosfatidai (NTP): Kaip substratams, NTP yra RNA pagrindinės vienetai. NTP koncentracijos aukštesnės nei 7 mM turi teigiamą poveikį mRNA gamybai.

Spermidinas: Stabilizuoja DNA-enzymų kompleksus ir skatiną transkripcijos reakcijas; visgi per didelės koncentracijos gali turėti stebuklingo poveikio. Rekomenduojama spermidino koncentracija yra tarp 1 ir 3 mM.

Organinis pirifosfatoidas (PPase): Pridėta į IVT reakciją, kad būtų užkirstas kelių organiniam pirofosfato jonui (PPi) susidomėjimui, vengiant jų jungimo su Mg2+ ir užtikrinant pakankamai laisvų Mg2+.

Naudojant inovacinę technologiją ir IVT mRNA patirtį, Yaohai Bio-Pharma siūlo visapusišką IVT RNA paslaugą, apimantį sekos dizainą, IVT RNA paruošimą (su m1ψ modifikacijomis), RNA ciklizavimą, šalinimą, šaldymo sušarvymą, LNP inkapsuliaciją ir kokybės testavimą.

Be to, aktyviai ieškome globalių institucinių ar asmeninių partnerių. Siūlome geresnį nei konkurentai atlyginimą. Jei turite bet kokios problemos, prašome ją kuo greičiau su mumis spręsti: [email protected]