IVT mRNR paruošimas

In vitro transkripcija (IVT) yra tinkamiausias mRNR paruošimo būdas, galintis gauti nuo mikrogramų iki miligramų mRNR laboratoriniu mastu. Tyrimo tikslais reagentų tiekėjai sukūrė universalias IVT reakcijų sistemas, tinkamas vidutinio ilgio (1000-4000 nukleotidų) mRNR.

Šiame straipsnyje apibendrinsime mRNR in vitro transkripciją (IVT), įskaitant įprastą IVT reakcijos sistemą, naudojamą laboratoriniu mastu, ir IVT reakcijos sistemą, tinkamą itin ilgam mRNR (>9000 nukleotidų).

Rinkiniai įgalina bendrą transkripcijos ribą su CleanCap AG ir sumažina imunogeniškumą naudojant m1ψ. DNazė I pašalina DNR likučius. Maža išeiga gali būti dėl prasto maišymo, reagento oksidacijos arba DNR šablono problemų, kurias galima sumažinti centrifuguojant, naudojant šviežius reagentus, kontrolines medžiagas ir koreguojant šablono kiekį/reakcijos laiką.

„Yaohai Bio-Pharma“ tiekia įvairius surenkamus IVT RNR produktus (skysti / liofilizuotus miltelius) ir gatavus LNP produktus, koduojančius baltymus, tokius kaip fluorescenciniai baltymai (eGFP, mCHERRY), luciferazę, rekombinazę Cre ir antigeną OVA, kad atitiktų įvairius eksperimentinius ar projektus. poreikius.

IVT sistema itin ilgam mRNR

Įprastas IVT gali neveikti per ilgai mRNR (>9000 nt). Reikia giliai suprasti ir racionaliai koreguoti IVT komponentus.

DNR šablonas: Linearizuotos plazmidės arba PGR produktai su atitinkamomis promotoriaus sekomis, ištirpinti H2O be RNazės. Optimalioms IVT sąlygoms rekomenduojama DNR šablono koncentracija didesnė nei 40 nM.

DTT: Transkripcijos metu palaiko fermentų aktyvumą. Siekiant optimalaus fermento aktyvumo, į reakcijos buferį reikia įpilti šviežio DTT.

Rnazės inhibitorius: Slopina RNazės aktyvumą ir palaiko mRNR stabilumą.

T7 RNR polimerazė: Katalizuoja DNR transkripciją į RNR, atitinkančią promotoriaus seką. T7 RNR polimerazės aktyvumą veikia pH ir magnio jonai.

Magnio jonai (Mg2+): RNR polimerazės kofaktorius. Per mažos koncentracijos sumažina transkripcijos efektyvumą, o per didelės koncentracijos sukelia RNR degradaciją. Laisvas [Mg2+] turi būti koreguojamas pagal nukleotidų koncentraciją. Kiekvienas nukleotidas sudaro chelatą po vieną [Mg2+], todėl [Mg2+] koncentracija turėtų viršyti bendrąją nukleotidų koncentraciją.

Nukleozidų trifosfatai (NTP): Kaip substratai, NTP yra pagrindiniai RNR vienetai. Didesnės nei 7 mM NTP koncentracijos turi teigiamą poveikį mRNR gamybai.

Spermidinas: Stabilizuoja DNR-fermentų kompleksus ir skatina transkripcijos reakcijas; tačiau per didelės koncentracijos turi slopinamąjį poveikį. Rekomenduojama spermidino koncentracija yra nuo 1 iki 3 mM.

Neorganinė pirofosfatazė (PPazė): Pridedama prie IVT reakcijų, kad nesikauptų neorganiniai pirofosfato jonai (PPi), išvengiama jų chelatacijos su Mg2+ ir užtikrinama pakankamai laisvo Mg2+.

Naudodama novatorišką technologiją ir IVT mRNR patirtį, Yaohai Bio-Pharma teikia vieno langelio IVT RNR paslaugą, apimančią sekos kūrimą, IVT RNR paruošimą (su m1ψ modifikacijomis), RNR ciklizavimą, gryninimą, džiovinimą šalčiu, LNP kapsuliavimą ir kokybės patikrinimą.

Taip pat aktyviai ieškome institucinių ar individualių pasaulinių partnerių. Mes siūlome konkurencingiausią atlyginimą pramonėje. Jei turite klausimų, nedvejodami susisiekite su mumis: [email protected]