Innovativa monteringstekniker för storskalig gensyntes

Sammansättningstekniken för att syntetisera stora DNA-fragment från grunden är hörnstenen i gensyntes, och omfattar metoder som BioBrick™, TAR, BglBrick, Golden Gate, Gibson-assembly, CPEC och Overlap PCR. På grund av begränsningarna hos nuvarande teknologi för att noggrant syntetisera DNA av genlängd i ett enda steg, är det nödvändigt att kombinera in vitro och in vivo monteringstekniker för att sätta samman oligonukleotidfragment syntetiserade i segment till långa DNA-fragment.

In vitro monteringstekniker

De klassificeras i olika metoder baserade på fragmentstorlek och sekvensegenskaper, med ett vanligt krav på att använda verktygsenzymer. Överlappande PCR, baserad på DNA-polymerasmetoden, är enkel och snabb i drift. Metoderna BioBrick och BglBrick, som är beroende av isoschizomerer, möjliggör standardiserad sammansättning, även om BioBrick-metoden är olämplig för fusionsproteiner. Golden Gate-kloningsmetoden, baserad på typ IIS-restriktionsenzymer, möjliggör effektiv sömlös ligering av flera fragment. Gibsons monteringsmetod, som använder en kombination av flera verktygsenzymer, möjliggör sömlös ligering med fragmentstorlekar som når flera hundra kb. Den standardiserade designen av DNA-komponenter ökar utnyttjandegraden av befintliga fragment.

In vivo monteringstekniker

Även vitro sammansatta fragment kan nå flera hundra kb i storlek, utbytet är ofta otillräckligt, vilket kräver amplifiering med hjälp av organismer som t.ex. Escherichia coli. Vid sammansättning av fragment som överstiger 20 kb används ofta rekombinanta system i organismer, inklusive Bacillus subtilis, jäst och konstruerade bakterier. Jäst, som en vanligen använd värd, har erkänts för sin effektiva homologa rekombinationsförmåga under många år. Den kan användas för att montera konstgjorda kromosomer upp till flera megabaser (Mb) i längd. Dessutom uppvisar Saccharomyces cerevisiae en extraordinär tolerans för kromosomlängd, vilket ger en teoretisk grund för att använda jäst för att konstruera ultralånga kromosomer i högre organismer.

Tillämpningar

Yaohai Bio-Pharma använder i första hand två sammansättningsmetoder för gensyntes: ligassammansättning och DNA-polymerassammansättning. Metoden för sammansättning av ligas kopplar samman överlappande och hybridiserade 5'-fosforylerade oligonukleotidfragment till dubbelsträngat DNA med hjälp av DNA-ligas. Polymerassammansättningsmetoden använder DNA-polymeras för att förlänga de överlappande oligonukleotidfragmenten genom hybridisering, erhålla en blandning av olika längder och slutligen amplifiera de framgångsrikt sammansatta fullängdsfragmenten med användning av primrar. Yaohai's kan hjälpa kunder att uppfylla specifika krav i gensyntes.

Vi söker också aktivt institutionella eller individuella globala partners. Vi erbjuder den mest konkurrenskraftiga ersättningen i branschen. Om du har några frågor är du välkommen att kontakta oss: [email protected]