Innovativa Sammansättningsmetoder för Storskalig Gensyntes

Tekniken för att sammanfoga stora DNA-fragment från grunden utgör grundstenen i genesyntes, och omfattar metoder som BioBrick™, TAR, BglBrick, Golden Gate, Gibson-sammanställning, CPEC och Overlap PCR. På grund av begränsningarna i den nuvarande tekniken att noggrant syntetisera DNA av genlängd på ett enda steg är det nödvändigt att kombinera in vitro och in vivo-sammanställningstekniker för att sammanfoga oligonukleotidfragment, som har synthetiserats i segment, till långa DNA-fragment.

In vitro-sammanställningstekniker

De klassas in i olika metoder baserat på fragmentstorlek och sekvenskaraktärer, med en gemensam krav på användning av verktygsenzym. Overlap PCR, som bygger på DNA polymerasemetoden, är enkel och snabb att utföra. BioBrick- och BglBrick-metoderna, som beror på isoschizomerer, möjliggör standardiserad sammansättning, även om BioBrick-metoden inte är lämplig för fusionsprotein. Golden Gate-kloningsmetoden, som bygger på typ IIS restriktionsenzym, gör det möjligt att liga flera fragment effektivt utan spår. Gibson-assembleringsmetoden, som utnyttjar en kombination av flera verktygsenzym, möjliggör spårbar ligation med fragmentstorlekar som når flera hundra kb. Standardiserad design av DNA-komponenter förbättrar användningsfrekvensen av befintliga fragment.

In vivo assembleringstekniker

Även om in vitro sammansatta fragment kan nå flera hundra kb i storlek, men uppgiften är ofta otillräcklig, vilket kräver förstärkning med organismer som Escherichia coli. Vid sammansättning av fragment som överstiger 20 kb används ofta rekombinanta system inom organismer, inklusive Bacillus subtilis, jäst och modifierade bakterier. Jäst, som en vanligt använd värdbast, har i många år erkänts för sin effektiva förmåga till homolog rekombination. Den kan användas för att sammansätta artificiella kromosomer upp till flera megabaser (Mb) i längd. Dessutom visar Saccharomyces cerevisiae en extraordinaire tolerans gentemot kromosomlängd, vilket ger en teoretisk grund för att använda jäst för att bygga ultra-långa kromosomer hos högre organismer.

Tillämpningar

Yaohai Bio-Pharma använder främst två sammansättningsmetoder för genesyntes: ligase-sammansättning och DNA-polymeras-sammansättning. Metoden med ligase ansluter överlappande och hybridiserade 5'-fosfaterade oligonukleotidfragment till dubbelsträngd DNA med hjälp av DNA-ligase. Polymeras-metoden använder DNA-polymeras för att förlänga de överlappande oligonukleotidfragmenten genom hybridisering, vilket ger en blandning av olika längder, och slutligen förstärker de framgångsrikt sammansatta fullständiga fragmenten med hjälp av primare. Yaohai kan hjälpa klienter att uppfylla specifika krav inom genesyntes.

Vi söker också aktivt globala partnerschaft med institutioner eller enskilda personer. Vi erbjuder den mest konkurrenskraftiga ersättningen inom branschen. Om du har några frågor, tveka inte att kontakta oss: [email protected]