mRNA 3' poly(A) karakterisering
mRNA 3' poly(A) karakterisering
3'-poly(A)-svansen (polyadenosiner) av mRNA är en integrerad del av post-transkriptionell reglering, vilket påverkar mRNA-export, stabilitet och translation. I fallet med in vitro-transkriberade (IVT) mRNA, introduceras poly(A)-svansen antingen under co-transkription på ett mallformat sätt eller genom en enzymatisk svansprocess på ett icke-templaterat sätt. Denna 3′ poly(A) fungerar som ett kritiskt kvalitetsattribut (CQA) för IVT RNA, vilket kräver noggrann karakterisering under både processutveckling och batchfrisättning.
Yaohai Bio-Pharma tillhandahåller specialiserade 3' poly(A)-karakteriseringstjänster, med tekniker som ribonukleas T1 (RNase T1)-klyvning, jonpar omvänd fas högpresterande vätskekromatografi (IP-RP-HPLC)/vätskekromatografi-masspektrometri (LC-MS), och omfattande dataanalys.
Regulatoriska krav för mRNA 3' poly(A) karakterisering
Enligt WHO:s reglerande överväganden, "integriteten hos strukturen av mRNA:t anses vara ett kritiskt kvalitetsattribut för frisättningen av mRNA:t. Sålunda behövs kontroll för mRNA-integritet, 5′ kapslingseffektivitet, 3′ poly(A) svansnärvaro eller längd och så vidare.”
Analytisk metod
Analys |
Metoder |
mRNA 3' poly(A) karakterisering |
LC-MS efter matsmältning |
Tillvägagångssätt
Steg 1. RNase T1-klyvning
Direkt analys av fullängds intakt mRNA med LC-MS är opraktisk på grund av dess storlek och heterogenitet. För att undersöka poly(A)-svansen måste den klyvas från fullängds-mRNA:t. Den vanliga metoden involverar enzymatisk nedbrytning med RNase T1, selektivt klyvning av 3'-änden av rG samtidigt som poly(A)-sekvensen bevaras. mRNA-provet genomgår digestion med RNase T1, och klyvningsfragment som innehåller poly(A)-sträckor isoleras med användning av oligo dT-belagda magnetiska pärlor.
Steg 2. IP-RP-HPLC/LC-MS
De extraherade svansarna genomgick analys med hjälp av LC-MS, vilket ger exakt information om svanslängden vid singelnukleotidupplösning. I oligonukleotid LC-MS-analys står jonparande omvändfas (IP-RP)-separationer med aminmobilfastillsatser som det föredragna kromatografiska läget, på grund av deras robusta upplösningsförmåga och kompatibilitet med masspektrometri (MS).
Steg 3. Dataanalys
Poly(A)-svanslängden och dess relativa mängd beror på antalet och intensiteten av toppar dividerat med en massa av adenosin. Vid bearbetning eller dekonvolutering av masspektrumet urskiljs den förväntade massan av en 100-mer poly(A)-svans (33,163 329 Da i låda), åtföljd av en serie massor åtskilda med XNUMX amu, motsvarande massan av adenosin (A) .
Fall av 3' poly(A) Karakterisering med LC–MS
Yaohai-BioPharma har utvecklat en robust metod för mRNA 3' poly(A) karakterisering, inklusive RNase T1-klyvning och IP-RP-HPLC/LC-MS.
Yaohai-BioPharma har utvecklat en robust metod för mRNA 3' poly(A) karakterisering, inklusive RNase T1-klyvning och IP-RP-HPLC/LC-MS.
EN
