mRNA 5'-kapslingseffektivitet
Betydelsen av mRNA 5'capping effektivitetsanalys
Cap-strukturen belägen vid 5′-änden av mRNA spelar en avgörande roll i effektiv translation, stabilisering och transport av mRNA inom eukaryoter. I samband med in vitro-transkriberat (IVT) mRNA, introduceras 5'-kapseln genom antingen co-transkriptionell kapning eller enzymatiska kapslingsprocesser. Som en oumbärlig komponent i IVT-RNA, står 5′-locket som ett kritiskt kvalitetsattribut (CQA) som kräver omfattande karakterisering genom processutveckling och batchfrisättning.
Yaohai-Bio Pharma tillhandahåller omfattande 5'-lösningar för analys av kapslingseffektivitet, som omfattar oligonukleotidskenor (sond), RNase H-klyvning, IP-RP-jonpar omvänd fas högpresterande vätskekromatografi (IP-RP-HPLC)/vätskekromatografi -masspektrometri (LC-MS), dataanalys.
Regulatoriska krav för mRNA-integritet
Enligt WHO:s reglerande överväganden, "integriteten hos strukturen av mRNA:t anses vara ett kritiskt kvalitetsattribut för frisättningen av mRNA:t. Sålunda behövs kontroll för mRNA-integritet, 5′ kapslingseffektivitet, 3′ poly(A) svansnärvaro eller längd och så vidare.”
Analytisk metod
Analys |
Metoder |
mRNA 5'-kapslingseffektivitet |
LC-MS efter matsmältning |
Tillvägagångssätt
Steg 1. Design av oligonukleotidskenor (sond).
Klyvningsproben, som inkorporerar 2'-O-metylnukleotider och tetradeoxiribonukleotider, tjänar till att klyva en komplementär RNA-sträng vid specifika positioner när RNas H är närvarande. Denna metod visar sig vara mycket värdefull för målinriktad generering av större RNA-fragment.
Steg 2. RNas H-klyvning
En biotinylerad sond, strategiskt utformad för att vara komplementär till 5'-änden av mRNA, appliceras tillsammans med RNas H för att katalysera den riktade klyvningen av 5'-änden av oligonukleotiden som har en cap-struktur.
Steg 3. IP-RP-HPLC/LC-MS
I oligonukleotid-LC-MS-analys är det föredragna kromatografiska läget jonparande omvändfas (IP-RP)-separationer med användning av aminmobilfastillsatser. Detta tillskrivs deras överlägsna upplösningsförmåga och kompatibilitet med masspektrometri (MS).
Steg 4. Dataanalys
Distinkta massor som observerats i klyvningsfragment med ett m7GpppG-lock, i motsats till de med ett difosfat-, trifosfat- eller ometylerat G-lock (GpppG), underlättar deras identifiering och möjliggör uppskattning av kapslingseffektiviteten.
Fall av kapslingseffektivitetsanalys med LC–MS
Yaohai-Bio Pharma har utvecklat robusta metoder för analys av mRNA-kapslingseffektivitet, från design av oligonukleotidskenor (sond), RNase H-klyvning, IP-RP-HPLC/LC-MS till dataanalys.
De totala jonkromatogrammen (vänster) och elektrospraymasspektra (höger) för 5'-ändsklyvningsfragment
EN
