Folosirea Puterii Strategiei de Fermentare Fed-batch

Pichia pastoris este folosită în mod extensiv în producerea unor diverse proteine heterologe. Tehnologia de Fermentare la Densitate Celulară Înaltă (HCDF), implementată prin alimentarea Fed-Batch, a reușit să atingă producția la scară largă a biofarmaceutcilor și enzyme industriale. În medii precis controlate, utilizarea tehnologiei HCDF poate obține proteine recombinante cu rendiment ridicat, activitate înaltă și costuri reduse.

Cercetările recente indică că prin strategii HCDF se fac eforturi pentru a crește producția și activitatea proteinelor heterologe în Pichia pastoris. Tehnologia HCDF permite obținerea ușoară a aglomeratelor celulare la nivel înalt în medii definite, ceea ce permite obținerea unei cantități abundente de proteine recombinante cu activitate îmbunătățită și costuri reduse prin HCDF. Cu toate acestea, selectarea strategiei HCDF potrivite pentru a optimiza expresia la nivel înalt a proteinelor specifice în Pichia pastoris rămâne o provocare.

Fermentare la Densitate Celulară Înaltă (HCDF)

Pichia pastoris se distinge în producerea de proteine heterologe, fiind preferată pentru HCDF în bioreactori automati. HCDF are 3 etape: lot cu glicerol, alimentare și inducere cu metanol. Yaohai Bio-Pharma se bucură de peste o deceniu de experiență în fermentarea microbială și a servit la peste 400 de proiecte. Compania deține o expertiză extensivă și tehnologie bine dezvoltată, ceea ce îi permite să folosească diferite strategii HCDF pentru a îmbunătăți eficiența producției de proteine.

Metanolul funcționează atât ca indusor al AOX1, cât și ca sursă de carbon, dar concentrația sa trebuie controlată pentru a preveni toxicitatea. Evaluarea diferitelor strategii de alimentare cu metanol este esențială pentru optimizarea creșterii Pichia pastoris și expresiei proteice.

Strategie de inducere cu metanol

În strategia de inducție cu metanol în HCDF fed-batch, strategiile de inducție bazate pe starea sistemului includ un set de metodologii de control care reglementează adăugarea suplimentară de metanol prin control online/offline sau control direct/ invers. Printre strategiile statistice de inducție, principalele includ μ-stat, Dissolved Oxygen (DO)-stat, methanol-stat și biomass-stat.

1.1 μ-stat

strategia μ-stat menține biomasa constantă prin controlul lui μ, ajutând la reproductibilitate și studierea efectului lui μ asupra expresiei proteică. Cu toate acestea, lipsesc controalele directe ale metanolului și DO, riscul de acumulare și generare de ROS fiind ridicat.

1.2 DO-stat

Strategia DO-stat reglează indirect alimentarea cu metanol prin controlul oxigenului dissolvat pentru a menține oxigenația, dar nu fixează concentrația de metanol și rata de creștere, ceea ce poate afecta studiul expresiei proteicale. Oxigenația reprezintă o provocare în fermentarea aerobă, iar deși suplimentarea cu oxigen pur poate fi costisitoare și toxica, consolidarea presiunii este o abordare mai economică care poate, de asemenea, să îmbunătățească activitatea proteinelor.

1.3 Methanol-stat

Controlul inadecvat al concentrației de metanol pune limite atât strategiei μ-stat, cât și celei DO-stat. Strategiile statistice de metanol, care funcționează într-un mod on/off, sunt predispuase la fluturări și lipsesc de precizie. În contrast, controloarele PID oferă o regulare mai precisă a concentrației de metanol, sporind eficacitatea totală a fermentării.

1.4 Biomasa-stat

Strategia biomass-stat definește relația dintre biomasa și alimentarea cu metanol, optimizând rata de alimentare cu metanol pentru a crește rendita proteinelor. Monitorizarea online a biomasei este mai practică, metoda preferată fiind citometria de flux. La o scară de 1000L, optimizarea ratei de alimentare cu metanol îmbunătățește semnificativ activitatea enzymei, rendita și productivitatea, depășind fermentarea în flacon.

Strategia de co-alimentare

Glicerolul, ca inhibitor al promotorului AOX1, trebuie să fie consumat integral înainte de inducția cu metanol pentru a evita suprimarea producției de proteine. Co-substratul poate să îmbunătățească activitatea enzymei, dar un exces de glicerol poate dăuna creșterii și expresiei. Sorbitolul, acidul ascobic, mannitolul și altele pot să înlocuiască glicerolul, reducând proteoliza și timpul de cultură și îmbunătățind expresia proteinelor.

Bancul de stocare necesită adoptarea metodelor adecvate de conservare și plasarea într-un mediu potrivit pentru a menține stabilitatea caracteristicilor stocului. Yaohai Bio-Pharma poate să îndeplinească cerințele de conservare a stocurilor cu glicerină (prin congelatoare cu temperaturi ultra-bajo sau azot lichid) și conservarea prin liofilizare a levurii și E. coli.

Strategie inducere prin restricție

În Pichia pastoris, condițiile restrictive precum DO scăzut, concentrația de metanol și limitarea oxigenului stimulează expresia proteinelor recombinante. Condițiile cu limitare de oxigen activează promotorul AOX1 prin acumularea de metanol, creșând producția de proteine în timp ce reduc căldura. Inducerea la temperaturi joase crește rendita, activitatea, stabilitatea și viabilitatea celulelor, dar adaugă costuri de răcire. Limitarea pH-ului și a nitrogenului ajută și la expresia proteinelor, necesitând precauție pentru a evita probleme operaționale. Limitarea nitrogenului crește semnificativ productivitatea specifică a proteinelor.

Yaohai Bio-Pharma caută, de asemenea, activ parteneri globali, instituționali sau individuali și oferă cele mai competitive compensații din industrie. Dacă aveți vreo întrebare, nu ezitați să ne contactați: [email protected]