Ontsluiten van de geheimen van hoogwaardige plasmidextractie

Plasmidextractie is cruciaal voor onderzoekers. Als genvectoren zijn plasmiden van vitaal belang in vaccinonderzoek en gentherapie, waarbij kwaliteit telt. Belangrijke kwaliteitsfactoren omvatten de supercoiled verhouding en het endotoxinegehalte. Regels variëren: FDA ≥80%, SMPA ≥85%, NMPA ≥90%, met <5% lineaire/ open-circulaire DNA. Klanten hebben vaak een voorkeur voor ≥95% supercoiled. Endotoxine niveaus zijn: onderzoek (>50 EU/µg), transfactie (<50 EU/µg) en vrij van endotoxines (<0.1 EU/µg).

Supercoiled Plasmid DNA

Plasmiden uit Escherichia coli omvatten supercoiled (SC), open-circulaire (OC) en lineaire (L) DNA. Een hoge SC-verhouding verhoogt de transfactie-efficiëntie en expressie. Bijvoorbeeld, een plasmid met 85.45% SC heeft 2.5x hogere transfactie, en een plasmid met 93.28% SC heeft 1.8x hogere HGF-expressie, wat de superioriteit van SC-DNA bevestigt.

Open-circulaire DNA: Wanneer een van de twee draden van dubbelstrands DNA breekt, wordt de supergesponnen structuur losser, waardoor een open-circulaire plasmid ontstaat met een groter volume dat het langzaamst migreert tijdens elektroforese en bovenaan staat.

Lineair DNA: Wanneer beide draden van plasmid-DNA breken, ontstaat er een lineaire structuur, met een relatief kleiner volume dat sneller migreert dan open-circulaire DNA maar trager dan supergesponnen DNA, op de tweede positie geplaatst.

Supergesponnen DNA: Twee helices verstrengelen zich, draaiend in een supergesponnen structuur gebaseerd op de DNA-helix. Het heeft het kleinste volume en migreert het snelst tijdens elektroforese, onderaan gepositioneerd.

Kwantitatieve Analyse van de Supergesponnen Verhouding

Laboratoria gebruiken agarose gel elektroforese (AGE) en Gel-Pro Analyzer om de verhouding van supergesponnen DNA te beoordelen via elektroforese-afbeeldingen. Een afbeelding toont 97,539% SC-DNA, terwijl een andere 63,833% SC en 36,167% OC-DNA toont (lineair DNA niet zichtbaar).

Het Geheim van Endotoxinen in Plasmiden

Endotoxine is een component van de buitenste laag van de celwand van gramnegatieve bacteriën, die wordt vrijgegeven na bacteriële dood of lysing, en bevat toxische lipopolysaccharide A. Tijdens plasmidextractie komt endotoxine in de lysopoplossing terecht, wat de transfectie-efficiëntie beïnvloedt en niet-specifieke immuunreacties activeert, wat leidt tot valse positieven in experimenten.

Kwantitatieve en kwalitatieve analyse van endotoxine

De Limulus amebocyte lysaat (LAL)-test detecteert endotoxine via agglutinatie met 2-keto-3-deoxyoctonzuur (KDO) in de lipopolysaccharide (LPS). Het is kwalitatief en semi-kwantitatief, waarbij de aanwezigheid van endotoxine wordt aangegeven door stolling of kleurverandering wanneer het met monsters wordt gemengd.

Yaohai Bio-Pharma biedt endotoxine-vrije supercoiled plasmiden aan. Outsourcing naar Yaohai verhoogt de transfectie- en expressie-efficiëntie. Geleverde plasmiden hebben een ≥95% SC-verhouding (gem. 85%±10%) en endotoxine-niveaus ≤0,1, ≤0,01 of ≤0,005 EU/μg.

Wij zoeken ook actief naar instellingen of individuen als wereldwijde partners. Wij bieden de meest concurrerende vergoeding in de industrie. Als u vragen heeft, aarzel dan niet om contact met ons op te nemen: [email protected]