Het ontrafelen van de geheimen van hoogwaardige plasmide-extractie

Plasmide-extractie is cruciaal voor onderzoekers. Als genvectoren zijn plasmiden van vitaal belang bij vaccinonderzoek en gentherapie, waar kwaliteit van belang is. Belangrijke kwaliteitsfactoren zijn supercoiled-proportion en endotoxinegehalte. Regelgeving varieert: FDA ≥80%, SMPA ≥85%, NMPA ≥90%, met <5% lineair/open-circulair DNA. Klanten geven vaak de voorkeur aan ≥95% supercoiled. Endotoxineniveaus zijn: onderzoek (>50 EU/µg), transfectie (<50 EU/µg) en endotoxinevrij (<0.1 EU/µg).

Supergewonden plasmide-DNA

Plasmiden van Escherichia coli omvatten supercoiled (SC), open-circulair (OC) en lineair (L) DNA. Een hoog SC-aandeel verhoogt de transfectie-efficiëntie en expressie. Bijvoorbeeld, de transfectie van een 85.45% SC-plasmide is 2.5x hoger en de HGF-expressie van een 93.28% SC-plasmide is 1.8x hoger, wat de superioriteit van SC-DNA bevestigt.

Open-circulair DNA: Wanneer één streng dubbelstrengs DNA breekt, raakt de supergewonden structuur los en ontstaat er een open-circulair plasmide met een groter volume dat het langzaamst migreert tijdens elektroforese en bovenaan is gepositioneerd.

Lineair DNA: Wanneer beide strengen van plasmide-DNA breken, ontstaat er een lineaire structuur met een relatief kleiner volume dat sneller migreert dan open-circulair DNA, maar langzamer dan supercoiled DNA, dat op de tweede plaats staat.

Supercoiled DNA: Twee helixen verstrengelen zich en draaien in een supercoiled structuur gebaseerd op de DNA-helix. Deze heeft het kleinste volume en migreert het snelst tijdens elektroforese, gepositioneerd aan de onderkant.

Kwantitatieve analyse van supergewonden proportie

Labs gebruiken agarosegelelektroforese (AGE) en Gel-Pro Analyzer om supercoiled-proportie te beoordelen via elektroforesebeelden. Eén beeld toont 97.539% SC DNA, terwijl een ander 63.833% SC en 36.167% OC DNA toont (lineair DNA niet zichtbaar).

Het geheim van endotoxine in plasmiden

Endotoxine is een component van de buitenste laag van de celwand van gramnegatieve bacteriën, die vrijkomt na bacteriële dood of lysis, en die het toxische lipopolysaccharide A bevat. Tijdens plasmide-extractie komt endotoxine in de lysisoplossing terecht, wat de transfectie-efficiëntie beïnvloedt en niet-specifieke immuunreacties triggert, wat leidt tot vals-positieve resultaten in experimenten.

Kwantitatieve en kwalitatieve analyse van endotoxine

De Limulus amebocyte lysate (LAL) test detecteert endotoxine via agglutinatie met 2-keto-3-deoxyoctonzuur (KDO) in de lipopolysaccharide (LPS). Het is kwalitatief en semi-kwantitatief en geeft de aanwezigheid van endotoxine aan via coagulatie of kleurverandering bij vermenging met monsters.

Yaohai Bio-Pharma biedt endotoxinevrije supercoiled plasmiden. Outsourcing naar Yaohai verhoogt de transfectie- en expressie-efficiëntie. Geleverde plasmiden hebben een SC-verhouding van ≥95% (gemiddeld 85%±10%) en endotoxineniveaus van ≤0.1, ≤0.01 of ≤0.005 EU/μg.

We zijn ook actief op zoek naar institutionele of individuele mondiale partners. Wij bieden de meest concurrerende verloning in de branche. Als u vragen heeft, neem dan gerust contact met ons op: [email protected]