Dezlegând Secretul Extragerii de Plasmid de Calitate Înaltă

Extracția plasmidului este crucială pentru cercetători. Ca vectori genici, plasmidele sunt vitale în cercetarea vaccinurilor și terapia genetică, unde calitatea contează. Factorii de calitate cheie includ proporția supercoilată și conținutul de endotoxine. Reglementările variază: FDA ≥80%, SMPA ≥85%, NMPA ≥90%, cu <5% DNA liniar/ circular-deschis. Clienții preferă adesea ≥95% supercoilat. Nivelurile de endotoxine sunt: cercetare (>50 EU/µg), transfecție (<50 EU/µg) și liber de endotoxine (<0.1 EU/µg).

DNA Plasmid Supercoilat

Plasmidele din Escherichia coli includ DNA supercoilat (SC), circular-deschis (OC) și liniar (L). O proporție SC ridicată crește eficiența de transfecție și expresia. De exemplu, o transfecție cu un plasmid de 85.45% SC este de 2.5 ori mai mare, iar expresia HGF a unui plasmid de 93.28% SC este de 1.8 ori mai mare, confirmând superioritatea DNA-ului SC.

ADN circular deschis: Când una dintre fire ale ADN-ului cu două fire se rupte, structura superîncoasă devine mai laxă, formând un plasmid circular deschis cu un volum mai mare care migrează cel mai încet în timpul electrofozei și este poziționat în partea de sus.

ADN liniar: Când ambele fire ale ADN-ului plasmidial se rupt, se formează o structură liniară, cu un volum relativ mai mic care migrează mai repede decât ADN-ul circular deschis, dar mai încet decât ADN-ul superîncoasă, fiind poziționat al doilea.

ADN superîncoasă: Cele două elice se întremesesc, twisterându-se într-o structură superîncoasă bazată pe elica ADN-ului. Acesta are cel mai mic volum și migrează cel mai rapid în timpul electrofozei, fiind poziționat în partea de jos.

Analiză cuantitativă a proporției superîncoase

Laboratoarele folosesc electrofoza în gel de agaroză (AGE) și Gel-Pro Analyzer pentru a evalua proporția superîncoasă prin imagini de electrofoză. O imagine arată 97,539% ADN SC, în timp ce alta arată 63,833% ADN SC și 36,167% ADN OC (ADN liniar nu este vizibil).

Secretul endotoxinelor din plasmide

Endotoxinul este un component al stratului exterioar al peretelui celular al bacteriilor Gram-negative, eliberat după moartea sau lizarea bacterială, conținând lipopolisacarida toxica A. În timpul extragerii plasmidei, endotoxinul intră în soluția de lizare, afectând eficiența transfecției și declanșând răspunsuri imune nespecifice, ceea ce duce la pozitiv false în experimente.

Analiza Cantitativă și Calitativă a Endotoxinului

Testul cu lisat de amebocite Limulus (LAL) detectează endotoxinul prin aglutinare cu 2-keto-3-deoxioctonica acidă (KDO) din lipopolisacarida (LPS). Este calitativ și semi-cantitativ, indicând prezența endotoxinului prin coagulare sau schimbarea culorii atunci când este amestecat cu probe.

Yaohai Bio-Pharma oferă plasmide supercoile fără endotoxine. Subcontractarea lui Yaohai îmbunătățește eficiența transfecției și expresiei. Plasmidele livrate au o proporție ≥95% SC (medie 85%±10%) și niveluri de endotoxină ≤0.1, ≤0.01 sau ≤0.005 EU/μg.

Cautăm activ parteneri instituționali sau individuali la nivel global. Ofertăm cea mai competitivă compensație din industrie. Dacă aveți întrebări, nu ezitați să ne contactați: CRO@yaohaibio.cn