Tehnici Inovatoare de Montare pentru Sinteza Genetică la Scară Mare

Tehnologia de montare pentru sintetizarea fragmentelor mari de ADN din zero reprezintă temelia sintezei de gene, cuprinzând metode precum BioBrick™, TAR, BglBrick, Golden Gate, montarea Gibson, CPEC și Overlap PCR. Din cauza limitărilor tehnologiei actuale în sintetizarea precisă a ADN-ului de lungime genomică într-o singură etapă, este necesar să se combina tehnici de asamblare in vitro și in vivo pentru a asambla fragmentele de oligonucleotide sintetizate pe porțiuni în fragmente mari de ADN.

Tehnici de asamblare in vitro

Ele sunt clasificate în diverse metode în funcție de dimensiunea fragmentului și caracteristicile secvenței, cu o cerință comună de a utiliza enzyme instrumentale. PCR-ul de suprapunere, bazat pe metoda DNA polymerase, este simplu și rapid în operațiune. Metodele BioBrick și BglBrick, care se bazează pe isoschizomere, permit asamblarea standardizată, deși metoda BioBrick nu este potrivită pentru proteinele de fuziune. Metoda de clonare Golden Gate, bazată pe enzyme de restricție de tip IIS, permite ligarea eficientă fărășeură a mai multor fragmente. Metoda de asamblare Gibson, care utilizează o combinație de mai multe enzyme instrumentale, permite ligarea fărășeură cu dimensiuni de fragmente ajungând la câteva sute de kb. Proiectarea standardizată a componentelor DNA crește rata de utilizare a fragmentelor existente.

Tehnici de asamblare in vivo

Deși in vitro fragmentele asamblate pot ajunge la mărimea de câteva sute de kb, dar rendimentul este adesea insuficient, necesitând amplificarea folosind organismele precum Escherichia coli. În montarea fragmentelor care depășesc 20 kb, se folosesc adesea sisteme recombinante în organismele vii, inclusiv Bacillus subtilis, levurile și bacteriile ingineriate. Levedura, ca gazdă frecvent utilizată, a fost recunoscută de mult pentru capacitatea sa de recombinație homologică eficientă. Poate fi folosită pentru a monta cromozomi artificiali până la câteva megabaze (Mb) în lungime. De asemenea, Saccharomyces cerevisiae prezintă o toleranță extraordinară față de lungimea cromozomului, oferind o bază teoretică pentru utilizarea levedurii în construirea cromozomilor ultra-lungi în organismele superioare.

Aplicații

Yaohai Bio-Pharma utilizează în principal două metode de montare pentru sinteza de gene: montarea cu ligaza și montarea cu DNA polymeraza. Metoda de montare cu ligaza conectează fragmentele oligonucleotidice fosforilate la 5' care se suprapun și hibridizează în DNA cu dublă spirală folosind ligaza DNA. Metoda de montare cu polymeraza utilizează DNA polymeraza pentru a extinde fragmentele oligonucleotidice care se suprapun prin hibridizare, obținând o amestecătură de lungimi diferite, și în cele din urmă amplifică fragmentele complet asamblate folosind probe. Yaohai poate să ajute clienții să își îndeplinească cerințele specifice în sinteza de gene.

Cautăm activ parteneri instituționali sau individuali la nivel global. Ofertăm cea mai competitivă compensație din industrie. Dacă aveți întrebări, nu ezitați să ne contactați: [email protected]