Tehnici inovatoare de asamblare pentru sinteza genelor la scară largă

Tehnologia de asamblare pentru sintetizarea fragmentelor mari de ADN de la zero este piatra de temelie a sintezei genelor, cuprinzând metode precum BioBrick™, TAR, BglBrick, Golden Gate, asamblarea Gibson, CPEC și Overlap PCR. Datorită limitărilor tehnologiei actuale în sintetizarea precisă a ADN-ului cu lungimea genei într-o singură etapă, este necesară combinarea tehnicilor de asamblare in vitro și in vivo pentru a asambla fragmente de oligonucleotide sintetizate în segmente în fragmente lungi de ADN.

Tehnici de asamblare in vitro

Ele sunt clasificate în diferite metode bazate pe dimensiunea fragmentului și caracteristicile secvenței, cu o cerință comună pentru utilizarea enzimelor instrument. PCR prin suprapunere, bazată pe metoda ADN polimerazei, este simplă și rapidă în funcționare. Metodele BioBrick și BglBrick, care se bazează pe izoschizomeri, permit asamblarea standardizată, deși metoda BioBrick nu este potrivită pentru proteinele de fuziune. Metoda de clonare Golden Gate, bazată pe enzime de restricție de tip IIS, permite ligarea eficientă fără sudură a mai multor fragmente. Metoda de asamblare Gibson, care utilizează o combinație de enzime de instrumente multiple, permite legarea fără sudură cu dimensiunile fragmentelor care ajung la câteva sute de kb. Designul standardizat al componentelor ADN mărește rata de utilizare a fragmentelor existente.

Tehnici de asamblare in vivo

Cu toate ca in vitro fragmentele asamblate pot atinge o dimensiune de câteva sute de kb, randamentul este adesea insuficient, necesitând amplificarea folosind organisme precum Escherichia coli. La asamblarea fragmentelor care depășesc 20 kb, sunt adesea folosite sisteme recombinate în cadrul organismelor, inclusiv Bacillus subtilis, drojdie și bacterii modificate. Drojdia, ca gazdă utilizată în mod obișnuit, a fost recunoscută pentru capacitatea sa eficientă de recombinare omoloagă de mulți ani. Poate fi folosit pentru a asambla cromozomi artificiali de până la câteva megabaze (Mb) în lungime. În plus, Saccharomyces cerevisiae prezintă o toleranță extraordinară pentru lungimea cromozomilor, oferind o bază teoretică pentru utilizarea drojdiei pentru a construi cromozomi ultra-lungi în organismele superioare.

Aplicatii

Yaohai Bio-Pharma folosește în primul rând două metode de asamblare pentru sinteza genelor: asamblarea ligazei și asamblarea ADN polimerazei. Metoda de asamblare a ligazei conectează fragmente de oligonucleotide 5’-fosforilate suprapuse și hibridizate în ADN dublu catenar folosind ADN ligază. Metoda de asamblare a polimerazei utilizează ADN polimeraza pentru a extinde fragmentele de oligonucleotide suprapuse prin hibridizare, obținând un amestec de lungimi diferite și, în final, amplificând fragmentele de lungime completă asamblate cu succes folosind primeri. Yaohai pot ajuta clienții să satisfacă cerințe specifice în sinteza genelor.

De asemenea, căutăm în mod activ parteneri instituționali sau individuali la nivel mondial. Oferim cea mai competitivă compensație din industrie. Dacă aveți întrebări, vă rugăm să nu ezitați să ne contactați: [email protected]