Methoden om de opbrengst van pDNA te verbeteren

De productie van plasmide-DNA (pDNA) is afhankelijk van genetische recombinatie, waarbij het doelgen en andere elementen worden verbonden om een ​​covalente gesloten circulaire structuur te vormen. Fermentatie met hoge celdichtheid van Escherichia coli en zuivering zijn de belangrijkste manieren om pDNA te produceren.

De ontwikkeling van cel- en gentherapie (CGT) en mRNA heeft meer mogelijkheden gebracht voor het voorkomen van epidemische ziekten en het behandelen van zeldzame ziekten. De industriële productie van CGT en mRNA vereist hoogwaardige pDNA. daarom geoptimaliseerde fermentatie van E. coli en hoge opbrengst van pDNA zijn cruciaal voor de kosteneffectiviteit van CGT- en mRNA-vaccins/geneesmiddelen.

1. Toenemende vraag naar pDNA

Volgens het Amerikaanse Plasmid DNA Manufacturing Market Report zal de CGT-markt naar verwachting groeien van 7.2 miljard USD in 2023 tot 23.3 miljard USD in 2028. Bovendien zal gentherapie de dominante richting van CGT worden. Steeds meer CGT-therapieën worden goedgekeurd voor marktintroductie en meer pijplijnen gaan de klinische fase in. Als gevolg hiervan stijgt de vraag naar pDNA enorm.

Naast CGT-therapieën is pDNA een essentiële grondstof voor de productie van mRNA-vaccins. Met de voortdurende innovatie van mRNA-technologie op het gebied van vaccins tegen infectieziekten, kankervaccins en behandelingen voor zeldzame ziekten, zal de vraag naar pDNA ook snel groeien.

2. Methoden om de opbrengst van pDNA te verbeteren

Met de toenemende vraag naar plasmide-DNA ligt de focus van de huidige technologische ontwikkeling op het optimaliseren van fermentatiestrategieën om de opbrengst van pDNA te verbeteren. De belangrijkste voorwaarden voor upstream procesontwikkeling omvatten componenten van kweekmedium, temperatuur, pH, opgeloste zuurstof (DO), specifieke productiesnelheid en fed-batchstrategieën.

Kweekmedium: Het kweekmedium voor fermentatie van E. coli gebruikt bij de productie van plasmiden is doorgaans een semi-synthetisch medium. Het is samengesteld uit koolstofbronnen, stikstofbronnen, anorganische zouten en sporenelementen. De soorten koolstof- en stikstofbronnen zijn van cruciaal belang voor de groei van E. coli en de accumulatie van producten. Veelgebruikte koolstofbronnen zijn glucose en glycerol, en stikstofbronnen omvatten organische en anorganische stikstofbronnen. Bovendien kan een te hoge koolstof-stikstofverhouding (C/N) de groei van de bacteriestam vertragen, terwijl een te lage C/N-verhouding snelle groei kan bevorderen, maar productaccumulatie kan beperken.

Temperatuur zone(s): De optimale temperatuur voor de groei van E. coli is 37°C. Lagere temperaturen (30-37°C) kunnen echter worden gebruikt bij batchfermentatie om de maximale specifieke productiesnelheid te verlagen, waardoor de plasmidereplicatie toeneemt. Voor hittegevoelige plasmiden kan het verhogen van de temperatuur tot 42°C een verdubbeling van het plasmidekopie-aantal veroorzaken.

pH: De optimale pH voor de groei van E. coli is 7±0.2. De pH van de fermentatiebouillon wordt gewoonlijk op peil gehouden door middel van zuur-basepompen.

DO: Het kritische bereik van de opgeloste zuurstofconcentratie voor E. coli is 20%-30%. Onvoldoende opgeloste zuurstof kan leiden tot overmatige productie van azijnzuur, wat de groei van bacteriën beïnvloedt en zelfs bacteriële autolyse veroorzaakt. Overmatig opgeloste zuurstof kan zuurstofvergiftiging veroorzaken. Factoren die opgeloste zuurstof beïnvloeden, zijn onder andere de roersnelheid, beluchtingssnelheid, enz.

Fed-batchstrategie: Fed-batch fermentatie wordt vaak gekozen voor plasmideproductie. Ten eerste is het bevorderlijk voor het bereiken van een hoge celdichtheid fermentatie van E coli, wat resulteert in meer biomassa, wat dient als basis voor een hoge opbrengst. Ten tweede beïnvloedt de buitensporig snelle groei van Escherichia coli de stabiliteit van plasmiden. De toevoeging van restrictieve voedingsstoffen met behulp van fed-batch kan de groeisnelheid van E. coli, waardoor de plasmideopbrengst wordt verhoogd. De DO-stat-controlestrategie wordt vaak gebruikt om fed-batch te reguleren tijdens plasmidefermentatie. Er is ook onderzoek dat de haalbaarheid van de pH-stat-strategie aangeeft.

3. Diensten geleverd door Yaohai Bio-Pharma

Yaohai Bio-Pharma heeft een volwassen platform ontwikkeld voor plasmideproductie. Daarnaast heeft Yaohai Bio-Pharma het basiskweekmedium, het voedingsmedium en de fermentatiecontrolestrategie geoptimaliseerd. Binnen een kweekcyclus van 30 uur overschrijdt de plasmideopbrengst 1 g/L.

Daarnaast is Yaohai Bio-Pharma in staat om procesoptimalisatieoplossingen te bieden op basis van single-factor of Design of Experiments (DoE)-methoden voor verschillende plasmiden en gastheerbacteriën. Yaohai Bio-Pharma streeft ernaar om te voldoen aan de eisen van klanten voor een hoge plasmideopbrengst en -kwaliteit.

Yaohai Bio-Pharma is ook actief op zoek naar institutionele of individuele wereldwijde partners en biedt de meest concurrerende compensatie in de industrie. Als u vragen heeft, neem dan gerust contact op met: [email protected]