IVT mRNA Voorbereiding

In vitro transcriptie (IVT) is de voorkeursmethode voor het bereiden van mRNA, in staat om microgrammen tot milligrammen mRNA op laboratoriumschaal te produceren. Voor onderzoeksdoeleinden hebben leveranciers van reagentia versatiele IVT-reactiesystemen ontwikkeld die geschikt zijn voor mRNA van matige lengte (1000-4000 nucleotiden).

In dit artikel zullen we in vitro transcriptie (IVT) van mRNA samenvatten, inclusief het conventionele IVT-reactiesysteem dat wordt gebruikt op laboratoriumschaal en het IVT-reactiesysteem dat geschikt is voor ultra-lange mRNA (>9000 nucleotiden).

Kits mogelijk maken co-transcriptioneel cappen met CleanCap AG en verlagen immunogeniteit met m1ψ. DNase I verwijdert residuele DNA. Een lage opbrengst kan komen door onvoldoende mengen, oxidatie van reagentia of problemen met het DNA-sjabloon, wat kan worden tegengewerkt door centrifugeren, verse reagentia, controles en aanpassing van het sjabloonbedrag/reactietijd.

Yaohai Bio-Pharma biedt verschillende vooraf gemaakte IVT RNA-producten (vloeistof/gereezeerd poeder) en LNP-eindproducten aan, die eiwitten coderen zoals fluorescente eiwitten (eGFP, mCHERRY), luciferase, recombinase Cre en antigen OVA, om verschillende experimentele of projectbehoeften te dekken.

IVT-systeem voor ultra-lange mRNA

Conventionele IVT werkt mogelijk niet voor overmatig lange mRNA (>9000 nt). Een diepgaande kennis en rationele aanpassing van IVT-componenten zijn nodig.

DNA-sjabloon: Lineariseerde plasmiden of PCR-producten met overeenkomstige promotersequenties, opgelost in RNase-vrije H2O. Een DNA-sjabloonconcentratie hoger dan 40 nM wordt aanbevolen voor optimale IVT-omstandigheden.

DTT: Houdt enzymactiviteit tijdens transcriptie in stand. Vers DTT moet worden toegevoegd aan het reactiebuffer voor optimale enzymactiviteit.

RNase-inhibitor: Remt RNase-activiteit en houdt mRNA-stabiliteit in stand.

T7 RNA-polymerase: Catalyseert de transcriptie van DNA naar RNA, overeenkomstig met de promotersequentie. De activiteit van T7 RNA polymerase wordt beïnvloed door pH en magnesiumionen.

Magnesiumionen (Mg2+): Een cofactor voor RNA polymerase. Te lage concentraties verminderen de transcriptie-efficiëntie, terwijl te hoge concentraties leiden tot RNA-degradatie. De vrije [Mg2+] moet worden aangepast op basis van de nucleotidemconcentratie. Elk nucleotide chelateert één [Mg2+], dus de [Mg2+] concentratie moet de totale nucleotidemconcentratie overschrijden.

Nucleoside Triphosphaten (NTP): Als substraten zijn NTP's de basiseenheden van RNA. NTP-concentraties boven 7 mM hebben een positief effect op mRNA-productie.

Spermidine: Stabiliseert DNA-enzymcomplexen en stimuleert transcriptiereacties; echter, te hoge concentraties hebben inhiberende effecten. De aanbevolen spermidineconcentratie ligt tussen 1 en 3 mM.

Inorganische Pirofosfaatase (PPase): Toegevoegd aan IVT-reacties om te voorkomen dat er inorganische pyrofosfaat-ionen (PPi) opbouwen, zodat ze niet cheleren met Mg2+ en er voldoende vrij Mg2+ blijft.

Door gebruik te maken van baanbrekende technologie en IVT mRNA-ervaring biedt Yaohai Bio-Pharma een volledige service voor IVT RNA, waaronder sequontieontwerp, IVT RNA-preparatie (met m1ψ-mods), RNA-cyclisatie, zuivering, vriezdrukken, LNP-omhulling en kwaliteitscontrole.

Wij zoeken ook actief naar instellingen of individuen als wereldwijde partners. Wij bieden de meest concurrerende vergoeding in de industrie. Als u vragen heeft, aarzel dan niet om contact met ons op te nemen: [email protected]