IVT mRNA-voorbereiding

In vitro transcriptie (IVT) is de voorkeursmethode voor het bereiden van mRNA, dat microgrammen tot milligrammen mRNA op laboratoriumschaal kan opleveren. Voor onderzoeksdoeleinden hebben reagensleveranciers veelzijdige IVT-reactiesystemen ontwikkeld die geschikt zijn voor mRNA van gemiddelde lengte (1000-4000 nucleotiden).

In dit artikel vatten we de in vitro transcriptie (IVT) van mRNA samen, inclusief het conventionele IVT-reactiesysteem dat op laboratoriumschaal wordt gebruikt en het IVT-reactiesysteem dat geschikt is voor ultralang mRNA (>9000 nucleotiden).

Kits maken co-transcriptionele capping met CleanCap AG mogelijk en verminderen immunogeniciteit met m1ψ. DNase I verwijdert rest-DNA. Lage opbrengst kan het gevolg zijn van slechte menging, oxidatie van reagens of problemen met DNA-templates, die kunnen worden verzacht door centrifugatie, verse reagentia, controles en het aanpassen van de templatehoeveelheid/reactietijd.

Yaohai Bio-Pharma levert diverse geprefabriceerde IVT RNA-producten (vloeibaar/gevriesdroogd poeder) en LNP-eindproducten, die coderen voor eiwitten zoals fluorescerende eiwitten (eGFP, mCHERRY), luciferase, recombinase Cre en antigeen OVA, om te voldoen aan verschillende experimentele of projectbehoeften.

IVT-systeem voor ultra-lange mRNA

Conventionele IVT werkt mogelijk niet voor te lange mRNA (>9000 nt). Een diepgaand begrip en rationele aanpassing van IVT-componenten zijn nodig.

DNA-sjabloon: Gelineariseerde plasmiden of PCR-producten met overeenkomstige promotorsequenties, opgelost in RNase-vrij H2O. Een DNA-templateconcentratie hoger dan 40 nM wordt aanbevolen voor optimale IVT-omstandigheden.

DTT: Handhaaft enzymactiviteit tijdens transcriptie. Verse DTT moet worden toegevoegd aan de reactiebuffer voor optimale enzymactiviteit.

RNase-remmer: Remt RNase-activiteit en handhaaft mRNA-stabiliteit.

T7 RNA-polymerase: Katalyseert DNA-transcriptie naar RNA, overeenkomend met de promotersequentie. De activiteit van T7 RNA-polymerase wordt beïnvloed door pH en magnesiumionen.

Magnesiumionen (Mg2+): Een cofactor voor RNA-polymerase. Te lage concentraties verminderen de transcriptie-efficiëntie, terwijl te hoge concentraties leiden tot RNA-afbraak. Vrije [Mg2+] moet worden aangepast op basis van de nucleotideconcentratie. Elke nucleotide cheleert één [Mg2+], dus de [Mg2+]-concentratie moet de totale nucleotideconcentratie overschrijden.

Nucleosidetrifosfaten (NTP): Als substraten zijn NTP's de basiseenheden van RNA. NTP-concentraties boven 7 mM hebben een positieve invloed op de mRNA-productie.

Spermidine: Stabiliseert DNA-enzymcomplexen en stimuleert transcriptiereacties; echter, overmatige concentraties hebben remmende effecten. De aanbevolen spermidineconcentratie ligt tussen 1 en 3 mM.

Anorganische pyrofosfatase (PPase): Toegevoegd aan IVT-reacties om de ophoping van anorganische pyrofosfaationen (PPi) te voorkomen, chelatie met Mg2+ te vermijden en voldoende vrij Mg2+ te garanderen.

Yaohai Bio-Pharma maakt gebruik van baanbrekende technologie en ervaring met IVT mRNA en biedt een allesomvattende IVT RNA-service, die sequentieontwerp, IVT RNA-voorbereiding (met m1ψ-mods), RNA-cyclisatie, zuivering, vriesdrogen, LNP-incapsulatie en kwaliteitstesten omvat.

We zijn ook actief op zoek naar institutionele of individuele mondiale partners. Wij bieden de meest concurrerende verloning in de branche. Als u vragen heeft, neem dan gerust contact met ons op: [email protected]