Innovatieve montage technieken voor grote schaal genetische synthese

De montage technologie voor het synthetiseren van grote DNA-fracties vanaf scratch is de hoeksteen van gen-synthese, met methoden zoals BioBrick™, TAR, BglBrick, Golden Gate, Gibson montage, CPEC en Overlap PCR. Vanwege de beperkingen van de huidige technologie om DNA van genlengte nauwkeurig in een keer te synthetiseren, is het nodig om in vitro en in vivo montage technieken te combineren om oligonucleotidenfracties die segmentgewijs zijn gesynthetiseerd samen te voegen tot lange DNA-fracties.

In vitro montage technieken

Ze worden ingedeeld in verschillende methoden op basis van fragmentgrootte en sequentiekenmerken, met een gemeenschappelijke eis voor het gebruik van hulpenzymen. Overlap-PCR, gebaseerd op de DNA-polymerase-methode, is eenvoudig en snel in uitvoering. De BioBrick en BglBrick-methoden, die afhankelijk zijn van isoschizomeren, maken gestandaardiseerde samenstelling mogelijk, hoewel de BioBrick-methode niet geschikt is voor fusie-eiwitten. De Golden Gate-cloningsmethode, gebaseerd op type IIS restrictie-enzymen, stelt efficiënte naadloze ligatie van meerdere fragmenten toe. De Gibson-assemblagemethode, die een combinatie van meerdere hulpenzymen gebruikt, maakt naadloze ligatie mogelijk met fragmentgroottes die tot enkele honderden kb kunnen lopen. De gestandaardiseerde ontwerpen van DNA-componenten verhogen de benuttingsgraad van bestaande fragmenten.

In vivo assemblagetechnieken

Hoewel in vitro de geassembleerde fragmenten kunnen enkele honderden kb in grootte bereiken, de opbrengst is vaak ontoereikend, wat vereist versterking met organismen zoals Escherichia coli. Bij het samenstellen van fragmenten die 20 kb overschrijden, worden vaak recombinante systemen binnen organismen gebruikt, waaronder Bacillus subtilis, gist en gemodificeerde bacteriën. Gist, als een veelgebruikte gastheer, wordt al jarenlang erkend om zijn efficiënte homologe recombinaatiecapaciteit. Het kan worden gebruikt om kunstmatige chromosomen tot verschillende megabases (Mb) in lengte samen te stellen. Bovendien tentoonstelt Saccharomyces cerevisiae een buitengewone tolerantie voor chromosoomlengte, wat een theoretische basis biedt voor het gebruik van gist bij het bouwen van ultra-lange chromosomen in hogere organismen.

Toepassingen

Yaohai Bio-Pharma gebruikt voornamelijk twee montage methoden voor genetische synthese: ligase montage en DNA polymerase montage. De ligase montage methode verbindt overlappende en geïybridiseerde 5'-fosforyleerde oligonucleotidenfragmenten tot dubbelstrandige DNA met behulp van DNA ligase. De polymerase montage methode maakt gebruik van DNA polymerase om de overlappende oligonucleotidenfragmenten door hybridisatie uit te breiden, waardoor een mengsel van verschillende lengtes ontstaat, en uiteindelijk de volledig gesynthetiseerde fragmenten met behulp van primers vermenigvuldigt. Yaohai kan klanten helpen om specifieke eisen in de genetische synthese te voldoen.

Wij zoeken ook actief naar instellingen of individuen als wereldwijde partners. Wij bieden de meest concurrerende vergoeding in de industrie. Als u vragen heeft, aarzel dan niet om contact met ons op te nemen: [email protected]