Innovatieve assemblagetechnieken voor grootschalige gensynthese Nederland

De assemblagetechnologie voor het synthetiseren van grote DNA-fragmenten vanaf nul is de hoeksteen van gensynthese, en omvat methoden zoals BioBrick™, TAR, BglBrick, Golden Gate, Gibson-assemblage, CPEC en Overlap PCR. Vanwege de beperkingen van de huidige technologie bij het nauwkeurig synthetiseren van DNA van genlengte in één stap, is het noodzakelijk om in vitro- en in vivo-assemblagetechnieken te combineren om oligonucleotidefragmenten die in segmenten zijn gesynthetiseerd, te assembleren tot lange DNA-fragmenten.

In vitro-assemblagetechnieken

Ze worden ingedeeld in verschillende methoden op basis van fragmentgrootte en sequentiekenmerken, met een gemeenschappelijke vereiste voor het gebruik van tool-enzymen. Overlap-PCR, gebaseerd op de DNA-polymerasemethode, is eenvoudig en snel in gebruik. De BioBrick- en BglBrick-methoden, die afhankelijk zijn van isoschizomeren, maken gestandaardiseerde assemblage mogelijk, hoewel de BioBrick-methode niet geschikt is voor fusie-eiwitten. De Golden Gate-kloneringsmethode, gebaseerd op type IIS-restrictie-enzymen, maakt efficiënte naadloze ligatie van meerdere fragmenten mogelijk. De Gibson-assemblagemethode, die gebruikmaakt van een combinatie van meerdere tool-enzymen, maakt naadloze ligatie mogelijk met fragmentgroottes die enkele honderden kb bereiken. Het gestandaardiseerde ontwerp van DNA-componenten verbetert de benuttingsgraad van bestaande fragmenten.

In vivo assemblagetechnieken

Hoewel in vitro geassembleerde fragmenten kunnen enkele honderden kb groot worden, de opbrengst is vaak onvoldoende, waardoor amplificatie met behulp van organismen zoals Escherichia coli. Bij het samenstellen van fragmenten die groter zijn dan 20 kb, worden vaak recombinante systemen binnen organismen gebruikt, waaronder Bacillus subtilis, gist en gemanipuleerde bacteriën. Gist, als een veelgebruikte gastheer, staat al jaren bekend om zijn efficiënte homologe recombinatiecapaciteit. Het kan worden gebruikt om kunstmatige chromosomen tot meerdere megabasen (Mb) lang te assembleren. Bovendien vertoont Saccharomyces cerevisiae een buitengewone tolerantie voor chromosoomlengte, wat een theoretische basis biedt voor het gebruik van gist om ultralange chromosomen te construeren in hogere organismen.

Toepassingen

Yaohai Bio-Pharma gebruikt voornamelijk twee assemblagemethoden voor gensynthese: ligase-assemblage en DNA-polymerase-assemblage. De ligase-assemblagemethode verbindt overlappende en gehybridiseerde 5'-gefosforyleerde oligonucleotidefragmenten tot dubbelstrengs DNA met behulp van DNA-ligase. De polymerase-assemblagemethode gebruikt DNA-polymerase om de overlappende oligonucleotidefragmenten te verlengen door hybridisatie, waardoor een mengsel van verschillende lengtes wordt verkregen en uiteindelijk de succesvol geassembleerde fragmenten van volledige lengte worden versterkt met behulp van primers. Yaohai kan klanten helpen om aan specifieke vereisten te voldoen bij gensynthese.

We zijn ook actief op zoek naar institutionele of individuele mondiale partners. Wij bieden de meest concurrerende verloning in de branche. Als u vragen heeft, neem dan gerust contact met ons op: [email protected]