Het benutten van de kracht van de Fed-batch Fermentatiestrategie

Pichia pastoris wordt breed gebruikt in de productie van verschillende heterologe eiwitten. De Technologie voor Fermentatie met Hoge Celconcentraties (HCDF), uitgevoerd via Fed-Batch voeding, heeft succesvol grote schaalproductie van biowerkstoffen en industriële enzymen bereikt. In nauwkeurig gereguleerde media kan de gebruikmaking van HCDF-technologie hoge opbrengsten, hoge activiteit en kosteneffectieve recombinante eiwitten opleveren.

Recent onderzoek wijst erop dat door HCDF-strategieën pogingen worden gedaan om de productie en activiteit van heterologe eiwitten in Pichia pastoris te verhogen. HCDF-technologie maakt het mogelijk om gemakkelijk hoge celclusters in gedefinieerde media te verkrijgen, waardoor overvloedige recombinante eiwitten met verbeterde activiteit en verlaagde kosten kunnen worden verkregen via HCDF. Het selecteren van de juiste HCDF-strategie om de hoogwaardige expressie van specifieke eiwitten in Pichia pastoris te optimaliseren blijft echter een uitdaging.

High-Cell-Density Fermentation (HCDF)

Pichia pastoris staat uitstekend in het veld van heterologe eiwitproductie, en wordt vooral gebruikt voor HCDF in geautomatiseerde bioreactoren. HCDF heeft drie fasen: glycerolbatch, voeding en methanolinductie. Yaohai Bio-Pharma heeft meer dan een decennium ervaring in microbiele fermentatie en heeft al meer dan 400 projecten uitgevoerd. Het bedrijf beschikt over uitgebreide expertise en goed ontwikkelde technologie, wat het in staat stelt verschillende HCDF-strategieën toe te passen om de efficiëntie van eiwitproductie te verbeteren.

Methanol fungeert zowel als inducer van AOX1 als als koolstofbron, maar zijn concentratie moet worden beheerd om toxiciteit te voorkomen. Het evalueren van verschillende methanolvoedingsstrategieën is cruciaal voor het optimaliseren van de groei van Pichia pastoris en eiwitexpressie.

Methanolinductiestrategie

In de fed-batch HCDF methanol-inductiestrategie omvatten statusgebaseerde inductiestrategieën een reeks controlemethodologieën die het aanvullende toevoegen van methanol reguleren via online/offline of voorwaartse/achterwaartse controle. Onder de statistische inductiestrategieën zijn de belangrijkste μ-stat, Dissolved Oxygen (DO)-stat, methanol-stat en biomass-stat.

1.1 μ-stat

de μ-stat strategie houdt biomassa stabiel door μ te controleren, wat reproduceerbaarheid ondersteunt en het effect van μ op eiwitexpressie bestudeert. Het heeft echter geen directe methanol- en DO-controle, wat het risico op accumulatie en ROS-productie vergroot.

1.2 DO-stat

De DO-stat strategie reguleert de methanolvoeding indirect door het oplossen zuurstofniveau te controleren om zuurstofverzadiging te handhaven, maar stelt de methanolconcentratie en groeisnelheid niet vast, wat de studie van eiwittenexpressie kan beïnvloeden. Zuurstofverzadiging vormt een uitdaging bij aerobe fermentatie, en hoewel het toevoegen van zuivere zuurstof kostbaar en toxisch kan zijn, is drukverhoging een economischere aanpak die ook eiwitactiviteit kan verbeteren.

1.3 Methanol-stat

Onvoldoende controle van de methanolconcentratie stelt beperkingen aan zowel μ-stat als DO-stat strategieën. Methanol-statistische strategieën, die in een aan/uit-modus opereren, zijn gevoelig voor fluctuaties en ontbreken nauwkeurigheid. In tegenstelling daarmee bieden PID-regelaars een nauwkeuriger regulering van de methanolconcentratie, waardoor de effectiviteit van de fermentatie wordt verbeterd.

1.4 Biomassa-stat

De biomass-stat strategie definieert de relatie tussen biomassa en methanolvoeding, waarbij de methanolvoedingsnelheid wordt geoptimaliseerd om de eiwitopbrengst te verbeteren. Online-monitoren van biomassa is praktischer, met flowcytometrie als de voorkeursmethode. Bij een schaal van 1000L leidt het optimaliseren van de methanolvoedingsnelheid tot een significant betere enzymactiviteit, opbrengst en productiviteit, wat beter presteert dan flesfermentatie.

Co-voedingsstrategie

Glycerol, als AOX1 promotor inhibitor, moet volledig zijn verbruikt voordat er methanolinductie plaatsvindt om eiwitproductie niet te onderdrukken. Co-substraten kunnen enzymactiviteit verbeteren, maar te veel glycerol kan schadelijk zijn voor groei en expressie. Sorbitol, ascorbinezuur, mannitol en andere kunnen glycerol vervangen, waardoor proteolyse en kweektijd worden gereduceerd en eiwitexpressie wordt verbeterd.

De stamcollectie vereist het aannemen van geschikte conserveringsmethoden en plaatsing in een geschikte omgeving om de stabiliteit van de streekkenmerken te handhaven. Yaohai Bio-Pharma kan voldoen aan de eisen voor conservatie van glicerolstocks (via ultra-lage temperatuurkoelkasten of vloeibare stikstof) en vriesdroging van gist en E. coli.

Beperkingsgeïnduceerde strategie

In Pichia pastoris verhogen beperkende condities zoals lage DO, methanolconcentratie en zuurstofbeperking de expressie van recombinant eiwit. Zuurstofbeperkte condities activeren de AOX1-promotor via opbouw van methanol, wat de eiwituitkomst verhoogt terwijl de warmte wordt verminderd. Laagtemperatuurinductie verhoogt de opbrengst, activiteit, stabiliteit en cellevensvatbaarheid, maar voegt koelkosten toe. pH en stikstofbeperking ondersteunen ook de expressie, met zorg nodig om operationele problemen te voorkomen. Stikstofbeperking verbetert merkbaar de specifieke eiwitproductiviteit.

Yaohai Bio-Pharma zoekt ook actief naar globale partners, zowel instellingen als individuen, en biedt de meest competitieve vergoeding in de branche. Als u vragen heeft, aarzel dan niet om contact met ons op te nemen: [email protected]