Het benutten van de kracht van de Fed-batch fermentatiestrategie

Pichia pastoris wordt veel gebruikt bij de productie van verschillende heterologe eiwitten. De High-Cell-Density Fermentation (HCDF)-technologie, geïmplementeerd via Fed-Batch-voeding, heeft met succes grootschalige productie van biofarmaceutica en industriële enzymen bereikt. In nauwkeurig gecontroleerde media kan het gebruik van HCDF-technologie recombinante eiwitten met een hoge opbrengst, hoge activiteit en kosteneffectieve recombinante eiwitten opleveren.

Recent onderzoek geeft aan dat er door middel van HCDF-strategieën wordt geprobeerd de productie en activiteit van heterologe eiwitten in Pichia pastoris te verhogen. HCDF-technologie maakt het mogelijk om moeiteloos celclusters op hoog niveau te verkrijgen in gedefinieerde media, waardoor de verwerving van overvloedige recombinante eiwitten met verbeterde activiteit en lagere kosten via HCDF mogelijk wordt. Het selecteren van de juiste HCDF-strategie om de expressie op hoog niveau van specifieke eiwitten in Pichia pastoris te optimaliseren, blijft echter een uitdaging.

Fermentatie met hoge celdichtheid (HCDF)

Pichia pastoris excelleert in heterologe eiwitproductie, favoriet voor HCDF in geautomatiseerde bioreactoren. HCDF heeft 3 fasen: glycerolbatch, voeding en methanolinductie. Yaohai Bio-Pharma kan bogen op meer dan tien jaar ervaring in microbiële fermentatie en heeft meer dan 400 projecten geholpen. Het bedrijf beschikt over uitgebreide expertise en goed ontwikkelde technologie, waardoor het verschillende HCDF-strategieën kan gebruiken om de efficiëntie van eiwitproductie te verbeteren.

Methanol dient zowel als inductor van AOX1 als koolstofbron, maar de concentratie ervan moet worden gecontroleerd om toxiciteit te voorkomen. Het evalueren van verschillende methanolvoedingsstrategieën is cruciaal voor het optimaliseren van de groei van Pichia pastoris en eiwitexpressie

Strategie voor methanolinductie

In de fed-batch HCDF methanol inductiestrategie omvatten state-based inductiestrategieën een set van controlemethodologieën die de aanvullende toevoeging van methanol reguleren via online/offline of forward/reverse controle. Onder de statistische inductiestrategieën zijn de belangrijkste μ-stat, Dissolved Oxygen (DO)-stat, methanol-stat en biomass-stat.

1.1 μ-stat

μ-stat-strategie houdt biomassa stabiel door μ te controleren, reproduceerbaarheid te bevorderen en het effect van μ op eiwitexpressie te bestuderen. Het mist echter directe methanol- en DO-controle, waardoor er een risico is op accumulatie en ROS-generatie.

1.2 DO-stat

De DO-stat-strategie reguleert indirect de methanoltoevoer door de opgeloste zuurstof te regelen om de zuurstofvoorziening te behouden, maar het fixeert niet de methanolconcentratie en groeisnelheid, wat de studie van eiwitexpressie kan beïnvloeden. Zuurstofvoorziening vormt een uitdaging bij aerobe fermentatie, en hoewel de aanvulling van zuivere zuurstof kostbaar en giftig kan zijn, is drukverhoging een meer economische benadering die ook de eiwitactiviteit kan verbeteren.

1.3 Methanol-stat

Onvoldoende controle van de methanolconcentratie brengt beperkingen met zich mee voor zowel μ-stat- als DO-stat-strategieën. Statistische methanolstrategieën, die in een aan/uit-modus werken, zijn gevoelig voor schommelingen en missen precisie. Daarentegen bieden PID-controllers een nauwkeurigere regeling van de methanolconcentratie, wat de algehele effectiviteit van de fermentatie verbetert.

1.4 Biomassa-stat

De biomassa-stat-strategie definieert de relatie tussen biomassa en methanolvoeding, waarbij de methanolvoedingssnelheid wordt geoptimaliseerd om de eiwitopbrengst te verbeteren. Online monitoring van biomassa is praktischer, waarbij flowcytometrie de voorkeursmethode is. Op een schaal van 1000L verbetert het optimaliseren van de methanolvoedingssnelheid de enzymactiviteit, opbrengst en productiviteit aanzienlijk, wat beter presteert dan kolffermentatie.

Co-feedingstrategie

Glycerol, als een AOX1-promotorremmer, moet volledig worden verbruikt vóór methanolinductie om te voorkomen dat de eiwitproductie wordt onderdrukt. Co-substraten kunnen de enzymactiviteit verbeteren, maar overtollige glycerol kan de groei en expressie schaden. Sorbitol, ascorbinezuur, mannitol en andere kunnen glycerol vervangen, waardoor de proteolyse en kweektijd worden verkort en de eiwitexpressie wordt verbeterd.

De stambank vereist het toepassen van geschikte conserveringsmethoden en plaatsing in een geschikte omgeving om de stabiliteit van stamkenmerken te behouden. Yaohai Bio-Pharma kan voldoen aan de vereisten voor glycerolvoorraadconservering (via ultra-lage temperatuurvriezers of vloeibare stikstof) en vriesdroogconservering van gist en E. coli.

Beperkingsgeïnduceerde strategie

Bij Pichia pastoris stimuleren beperkende omstandigheden zoals lage DO, methanolconcentratie en zuurstoflimiet de expressie van recombinant eiwit. Zuurstofbeperkte omstandigheden activeren de AOX1-promotor via methanolaccumulatie, waardoor de eiwitproductie toeneemt en de warmte afneemt. Inductie bij lage temperaturen verbetert de opbrengst, activiteit, stabiliteit en levensvatbaarheid van de cel, maar brengt koelkosten met zich mee. pH- en stikstofbeperking helpen ook bij de expressie, wat voorzichtigheid vereist om operationele problemen te voorkomen. Stikstofbeperking verbetert met name de specifieke eiwitproductiviteit.

Yaohai Bio-Pharma is ook actief op zoek naar institutionele of individuele wereldwijde partners en biedt de meest concurrerende compensatie in de industrie. Als u vragen heeft, neem dan gerust contact met ons op: [email protected]