Mengungkap Rahasia Ekstraksi Plasmid Berkualitas Tinggi

Ekstraksi plasmid sangat penting bagi para peneliti. Sebagai vektor gen, plasmid memiliki peran vital dalam penelitian vaksin dan terapi gen, di mana kualitas menjadi faktor utama. Faktor kualitas utama meliputi proporsi superkoil dan kandungan endotoksin. Peraturan berbeda-beda: FDA ≥80%, SMPA ≥85%, NMPA ≥90%, dengan <5% DNA linear/lingkaran-terbuka. Klien sering kali lebih suka ≥95% superkoil. Tingkat endotoksin adalah: penelitian (>50 EU/µg), transfeksi (<50 EU/µg), dan bebas endotoksin (<0.1 EU/µg).

DNA Plasmid Superkoil

Plasmid dari Escherichia coli mencakup DNA superkoil (SC), lingkaran-terbuka (OC), dan linear (L). Proporsi SC yang tinggi meningkatkan efisiensi transfeksi dan ekspresi. Sebagai contoh, transfeksi plasmid SC 85.45% lebih tinggi 2,5x, dan ekspresi HGF plasmid SC 93.28% lebih tinggi 1,8x, mengonfirmasi keunggulan DNA SC.

DNA lingkaran terbuka: Ketika salah satu rantai dari DNA ber rantai ganda putus, struktur superkoil menjadi longgar, membentuk plasmid lingkaran terbuka dengan volume yang lebih besar yang bermigrasi paling lambat selama elektroforesis dan berada di bagian atas.

DNA linier: Ketika kedua rantai DNA plasmid putus, sebuah struktur linier terbentuk, dengan volume yang relatif lebih kecil yang bermigrasi lebih cepat daripada DNA lingkaran terbuka tetapi lebih lambat daripada DNA superkoil, berada pada posisi kedua.

DNA superkoil: Dua heliks saling kait, membentuk struktur superkoil berdasarkan heliks DNA. Ini memiliki volume terkecil dan bermigrasi paling cepat selama elektroforesis, berada di bagian bawah.

Analisis Kuantitatif Proporsi Superkoil

Laboratorium menggunakan elektroforesis gel agarosa (AGE) dan Gel-Pro Analyzer untuk menilai proporsi superkoil melalui gambar elektroforesis. Gambar pertama menunjukkan 97,539% DNA SC, sementara yang lainnya menunjukkan 63,833% DNA SC dan 36,167% DNA OC (DNA linier tidak terlihat).

Rahasia Endotoksin dalam Plasmid

Endotoksin adalah komponen lapisan luar dinding sel bakteri Gram-negatif, yang dilepaskan setelah kematian atau lisifikasi bakteri, mengandung lipopolisakarida A yang beracun. Selama ekstraksi plasmid, endotoksin memasuki larutan lisat, memengaruhi efisiensi transfeksi dan memicu respons imun nonspesifik, yang dapat menyebabkan hasil positif palsu dalam eksperimen.

Analisis Kuantitatif dan Kualitatif Endotoksin

Uji Limulus amebocyte lysate (LAL) mendeteksi endotoksin melalui penggumpalan dengan asam 2-keto-3-deoksioktonat (KDO) dalam lipopolisakarida (LPS). Uji ini bersifat kualitatif dan semi-kuantitatif, menunjukkan keberadaan endotoksin melalui pembekuan atau perubahan warna ketika dicampur dengan sampel.

Yaohai Bio-Pharma menawarkan plasmid supercoil bebas endotoksin. Outsourcing ke Yaohai meningkatkan efisiensi transfeksi dan ekspresi. Plasmid yang dikirim memiliki proporsi ≥95% SC (rata-rata 85%±10%) dan tingkat endotoksin ≤0,1, ≤0,01, atau ≤0,005 EU/μg.

Kami juga secara aktif mencari mitra global, baik lembaga maupun individu. Kami menawarkan kompensasi paling kompetitif di industri. Jika Anda memiliki pertanyaan, silakan hubungi kami: [email protected]