Persiapan IVT mRNA

Transkripsi in vitro (IVT) adalah metode yang disukai untuk menyiapkan mRNA, mampu menghasilkan mikrogram hingga miligram mRNA pada skala laboratorium. Untuk tujuan penelitian, pemasok reagen telah mengembangkan sistem reaksi IVT yang fleksibel yang cocok untuk mRNA dengan panjang sedang (1000-4000 nukleotida).

Dalam artikel ini, kami akan merangkum transkripsi in vitro (IVT) dari mRNA, termasuk sistem reaksi IVT konvensional yang digunakan pada skala laboratorium dan sistem reaksi IVT yang cocok untuk mRNA ultra-panjang (>9000 nukleotida).

Kit memungkinkan penutupan kofranskripsi dengan CleanCap AG dan mengurangi imunogenisitas dengan m1ψ. DNase I menghilangkan DNA residu. Hasil rendah dapat disebabkan oleh pencampuran yang buruk, oksidasi reagen, atau masalah template DNA, yang dapat diminimalkan dengan sentrifugasi, reagen segar, kontrol, dan penyesuaian jumlah template/waktu reaksi.

Yaohai Bio-Pharma menyediakan berbagai produk IVT RNA siap pakai (cairan/bubuk beku) dan produk LNP, yang mengkodekan protein seperti protein fluoresen (eGFP, mCHERRY), luciferase, rekombinase Cre, dan antigen OVA, untuk memenuhi kebutuhan eksperimen atau proyek yang berbeda.

Sistem IVT untuk mRNA Ultra-panjang

IVT konvensional mungkin tidak berhasil untuk mRNA yang sangat panjang (>9000 nt). Diperlukan pemahaman mendalam dan penyesuaian rasional dari komponen IVT.

Templat DNA: Plasmid linear atau produk PCR dengan urutan promotor yang sesuai, dilarutkan dalam H2O bebas RNase. Konsentrasi templat DNA lebih dari 40 nM disarankan untuk kondisi IVT optimal.

DTT: Menjaga aktivitas enzim selama transkripsi. DTT segar harus ditambahkan ke buffer reaksi untuk aktivitas enzim optimal.

Inhibitor RNase: Menghambat aktivitas RNase dan menjaga stabilitas mRNA.

Polimerase RNA T7: Mengkatalisis transkripsi DNA menjadi RNA, sesuai dengan urutan promotor. Aktivitas polimerase RNA T7 dipengaruhi oleh pH dan ion magnesium.

Ion Magnesium (Mg2+): Kofaktor untuk polimerase RNA. Konsentrasi yang terlalu rendah mengurangi efisiensi transkripsi, sementara konsentrasi yang terlalu tinggi menyebabkan degradasi RNA. [Mg2+] bebas harus disesuaikan berdasarkan konsentrasi nukleotida. Setiap nukleotida mengikat satu [Mg2+], jadi konsentrasi [Mg2+] harus melebihi total konsentrasi nukleotida.

Nukleosida Trifosfat (NTP): Sebagai substrat, NTP adalah unit dasar RNA. Konsentrasi NTP di atas 7 mM memiliki dampak positif pada produksi mRNA.

Spermidin: Memperstabilkan kompleks DNA-enzim dan merangsang reaksi transkripsi; namun, konsentrasi yang berlebihan memiliki efek penghambatan. Konsentrasi spermidin yang direkomendasikan adalah antara 1 dan 3 mM.

Pirofosfatase Anorganik (PPase): Ditambahkan ke reaksi IVT untuk mencegah akumulasi ion pirrofosfat anorganik (PPi), menghindari pengikatan mereka dengan Mg2+ dan memastikan adanya Mg2+ bebas yang cukup.

Dengan memanfaatkan teknologi inovatif dan pengalaman mRNA IVT, Yaohai Bio-Pharma menyediakan layanan RNA IVT satu atap, mencakup desain urutan, persiapan RNA IVT (dengan modifikasi m1ψ), siklisasi RNA, pemurnian, pelepasan beku, enkapsulasi LNP, dan pengujian kualitas.

Kami juga secara aktif mencari mitra global, baik lembaga maupun individu. Kami menawarkan kompensasi paling kompetitif di industri. Jika Anda memiliki pertanyaan, silakan hubungi kami: [email protected]