Persiapan mRNA IVT

Transkripsi in vitro (IVT) merupakan metode yang lebih disukai untuk menyiapkan mRNA, yang mampu menghasilkan mikrogram hingga miligram mRNA dalam skala laboratorium. Untuk keperluan penelitian, pemasok reagen telah mengembangkan sistem reaksi IVT serbaguna yang cocok untuk mRNA dengan panjang sedang (1000-4000 nukleotida).

Dalam artikel ini, kami akan merangkum transkripsi in vitro (IVT) mRNA, termasuk sistem reaksi IVT konvensional yang digunakan dalam skala laboratorium dan sistem reaksi IVT yang cocok untuk mRNA ultra-panjang (>9000 nukleotida).

Kit memungkinkan pembatasan ko-transkripsi dengan CleanCap AG dan mengurangi imunogenisitas dengan m1ψ. DNase I membuang DNA yang tersisa. Hasil yang rendah dapat disebabkan oleh pencampuran yang buruk, oksidasi reagen, atau masalah pola DNA, yang dapat diatasi dengan sentrifugasi, reagen baru, kontrol, dan penyesuaian jumlah pola/waktu reaksi.

Yaohai Bio-Pharma menyediakan berbagai produk IVT RNA prefabrikasi (bubuk cair/beku-kering) dan produk jadi LNP, yang mengkode protein seperti protein fluoresensi (eGFP, mCHERRY), luciferase, rekombinase Cre, dan antigen OVA, untuk memenuhi berbagai kebutuhan eksperimen atau proyek.

Sistem IVT untuk mRNA Ultra-panjang

IVT konvensional mungkin tidak bekerja untuk mRNA yang terlalu panjang (>9000 nt). Diperlukan pemahaman yang mendalam dan penyesuaian rasional terhadap komponen-komponen IVT.

Templat DNA: Plasmid yang dilinearisasi atau produk PCR dengan urutan promotor yang sesuai, dilarutkan dalam H2O bebas RNase. Konsentrasi cetakan DNA yang lebih tinggi dari 40 nM direkomendasikan untuk kondisi IVT yang optimal.

DTT: Mempertahankan aktivitas enzim selama transkripsi. DTT segar harus ditambahkan ke buffer reaksi untuk aktivitas enzim yang optimal.

Penghambat RNase: Menghambat aktivitas RNase dan menjaga stabilitas mRNA.

T7 RNA Polimerase: Mengkatalisis transkripsi DNA menjadi RNA, sesuai dengan urutan promotor. Aktivitas RNA polimerase T7 dipengaruhi oleh pH dan ion magnesium.

Ion Magnesium (Mg2+): Kofaktor untuk RNA polimerase. Konsentrasi yang terlalu rendah mengurangi efisiensi transkripsi, sedangkan konsentrasi yang terlalu tinggi menyebabkan degradasi RNA. [Mg2+] bebas harus disesuaikan berdasarkan konsentrasi nukleotida. Setiap nukleotida mengkelat satu [Mg2+], sehingga konsentrasi [Mg2+] harus melebihi konsentrasi nukleotida total.

Nukleosida Trifosfat (NTP): Sebagai substrat, NTP merupakan unit dasar RNA. Konsentrasi NTP di atas 7 mM memiliki dampak positif pada produksi mRNA.

Spermidin: Menstabilkan kompleks DNA-enzim dan merangsang reaksi transkripsi; namun, konsentrasi yang berlebihan memiliki efek penghambatan. Konsentrasi spermidine yang direkomendasikan adalah antara 1 dan 3 mM.

Pirofosfatase Anorganik (PPase): Ditambahkan ke reaksi IVT untuk mencegah akumulasi ion pirofosfat anorganik (PPi), menghindari kelasi dengan Mg2+ dan memastikan cukupnya Mg2+ bebas.

Dengan memanfaatkan teknologi perintis dan pengalaman mRNA IVT, Yaohai Bio-Pharma menyediakan layanan IVT RNA terpadu, yang mencakup desain sekuens, persiapan IVT RNA (dengan mod m1ψ), siklisasi RNA, pemurnian, pengeringan beku, enkapsulasi LNP, dan pengujian kualitas.

Kami juga secara aktif mencari mitra global institusional atau individu. Kami menawarkan kompensasi paling kompetitif di industri. Jika Anda memiliki pertanyaan, jangan ragu untuk menghubungi kami: Alamat: [email protected]