mRNA 3' поли(А) Карактеризација
mRNA 3' поли(А) Карактеризација
3' поли(А) опашката (полиаденозини) на mRNA е составен дел на пост-транскрипциската регулација, што влијае на извозот, стабилноста и транслацијата на mRNA. Во случај на ин витро-транскриптирани (IVT) mRNAs, поли(А) опашката се воведува или за време на ко-транскрипција на шаблонски начин или преку ензимски процес на опашка на не-шаблонски начин. Овој 3' поли(А) служи како атрибут за критичен квалитет (CQA) за IVT RNA, што бара темелна карактеризација и за време на развојот на процесот и на ослободувањето на серијата.
Yaohai Bio-Pharma обезбедува специјализирани услуги за карактеризација на 3' поли(А), користејќи техники како што се расцепување на рибонуклеаза T1 (RNase T1), течна хроматографија со високи перформанси со обратна фаза со јонски пар (IP-RP-HPLC)/течна хроматографија-масена спектрометрија (LC-MS), и сеопфатна анализа на податоци.
Регулаторни барања за mRNA 3' poly(A) Карактеризација
Според регулаторните размислувања на СЗО, „интегритетот на структурата на mRNA се смета за критичен квалитет за ослободување на mRNA. Така, потребна е контрола за интегритетот на mRNA, 5' ефикасност на капа, 3' поли(А) присуство или должина на опашката и така натаму.
Аналитички метод
Анализа | Методи |
mRNA 3' поли(А) карактеризација | LC-MS по варење |
постапка
Чекор 1. Расцепување на RNase T1
Директната анализа на непроменета mRNA со целосна должина со LC-MS е непрактична поради нејзината големина и хетерогеност. За да се испита поли(А) опашката, таа мора да се одвои од мРНК со целосна должина. Распространетиот метод вклучува ензимско варење со RNase T1, селективно расцепување на 3' крајот на rG додека се зачувува поли(А) секвенцата. Примерокот на mRNA се подложува на дигестија со RNase T1, а фрагментите на расцепување кои содржат поли(А) истегнувања се изолирани со помош на магнетни зрна обложени со олиго dT.
Чекор 2. IP-RP-HPLC/LC-MS
Извлечените опашки беа подложени на анализа со помош на LC-MS, нудејќи прецизни информации за должината на опашката со резолуција од еден нуклеотид. Во анализата на олигонуклеотидните LC-MS, сепарациите со обратна фаза на спарување на јони (IP-RP) со адитиви за мобилна фаза на амин стојат како претпочитан хроматографски режим, поради нивната робусна моќ на разрешување и компатибилност со масената спектрометрија (MS).
Чекор 3. Анализа на податоци
Должината на поли(А) опашката и нејзиното релативно изобилство зависат од бројот и интензитетот на врвовите поделени со масата на аденозин. По обработката или деконволутирањето на масениот спектар, се забележува очекуваната маса на опашка од 100-мерна поли(А) (33,163 Da во кутија), придружена со низа маси распоредени со 329 amu, што е еквивалентно на масата на аденозин (A) .
Случај на 3' поли(А) Карактеризација со LC–MS
Yaohai-BioPharma разви робустен метод за карактеризација на mRNA 3' poly(A), вклучувајќи расцепување на RNase T1 и IP-RP-HPLC/LC-MS.
Yaohai-BioPharma разви робустен метод за карактеризација на mRNA 3' poly(A), вклучувајќи расцепување на RNase T1 и IP-RP-HPLC/LC-MS.
EN
