mRNA 5'capping Ефикасност
Значењето на mRNA 5'capping анализа на ефикасност
Структурата на капа лоцирана на 5' крајот на mRNA игра клучна улога во ефикасното преведување, стабилизирање и транспортирање на mRNA во еукариотите. Во контекст на ин витро-транскриптираната (IVT) mRNA, 5' капа се воведува или преку процесите на ко-транскрипциско покривање или ензимско покривање. Како незаменлива компонента на IVT RNAs, капачето 5' стои како атрибут за критичен квалитет (CQA) што бара сеопфатна карактеризација во текот на развојот на процесот и ослободувањето на сериите.
Yaohai-Bio Pharma обезбедува сеопфатни решенија за анализа на ефикасноста на покривање 5', кои опфаќаат дизајн на олигонуклеотидни шини (сонда), расцепување на RNase H, обратна фаза на течна хроматографија со високи перформанси на IP-RP- јонски пар (IP-RP-HPLC)/течна хроматографија -масена спектрометрија (LC-MS), анализа на податоци.
Регулаторни барања за интегритет на mRNA
Според регулаторните размислувања на СЗО, „интегритетот на структурата на mRNA се смета за критичен квалитет за ослободување на mRNA. Така, потребна е контрола за интегритетот на mRNA, 5' ефикасност на капа, 3' поли(А) присуство или должина на опашката и така натаму.
Аналитички метод
Анализа |
Методи |
mRNA 5'capping Ефикасност |
LC-MS по варење |
постапка
Чекор 1. Дизајн на олигонуклеотидни шини (сонда).
Сондата за расцепување, која вклучува 2'-O-метилнуклеотиди и тетрадеоксирибонуклеотиди, служи за расцепување на комплементарна РНК влакно на специфични позиции кога е присутна RNase H. Овој метод се покажува како многу вреден за целното генерирање на поголеми фрагменти на РНК.
Чекор 2. Расцепување на RNase H
Биотинилирана сонда, стратешки дизајнирана да биде комплементарна на 5' крајот на mRNA, се применува заедно со RNase H за да го катализира целното расцепување на олигонуклеотидот со 5' крај кој поседува капа структура.
Чекор 3. IP-RP-HPLC/LC-MS
Во анализата на олигонуклеотидната LC-MS, претпочитаниот хроматографски режим е сепарациите со обратна фаза на спарување со јони (IP-RP) кои користат адитиви на амини подвижни фази. Ова се припишува на нивната супериорна моќ на разрешување и компатибилност со масената спектрометрија (MS).
Чекор 4. Анализа на податоци
Различните маси забележани во фрагментите на расцепување со капа од m7GpppG, за разлика од оние со дифосфат, трифосфат или неметилирана G капа (GpppG), ја олеснуваат нивната идентификација и овозможуваат проценка на ефикасноста на затварањето.
Случај на анализа на ефикасноста на ограничување со LC–MS
Јаохаи-Био Фарма разви робусни методи за анализа на ефикасноста на покривање на mRNA, од дизајн на олигонуклеотидни шини (сонда), расцепување на RNase H, IP-RP-HPLC/LC-MS до анализа на податоци.
Вкупните јонски хроматограми (лево) и масените спектри на електропрскање (десно) на фрагменти на расцепување со 5' крај
EN
