Teknik Perakitan Inovatif untuk Sintesis Gen Skala Besar

Teknologi perakitan untuk sintesis fragmen DNA besar dari awal merupakan batu pondasi dari sintesis gen, mencakup metode seperti BioBrick™, TAR, BglBrick, Golden Gate, Gibson assembly, CPEC, dan Overlap PCR. Karena keterbatasan teknologi saat ini dalam mensintesis DNA panjang gen secara akurat dalam satu langkah, diperlukan untuk menggabungkan teknik perakitan in vitro dan in vivo untuk merakit fragmen oligonukleotida yang disintesis secara bertahap menjadi fragmen DNA panjang.

Teknik perakitan in vitro

Mereka diklasifikasikan ke dalam berbagai metode berdasarkan ukuran fragmen dan karakteristik urutan, dengan persyaratan umum untuk menggunakan enzim alat. Overlap PCR, yang didasarkan pada metode DNA polimerase, sederhana dan cepat dalam operasinya. Metode BioBrick dan BglBrick, yang bergantung pada isoschizomer, memungkinkan perakitan yang terstandar, meskipun metode BioBrick tidak cocok untuk protein fusi. Metode kloning Golden Gate, yang didasarkan pada enzim restriksi tipe IIS, memungkinkan ligasi tanpa sambungan yang efisien dari beberapa fragmen. Metode perakitan Gibson, yang menggunakankan kombinasi beberapa enzim alat, memungkinkan ligasi tanpa sambungan dengan ukuran fragmen mencapai ratusan kb. Desain terstandar dari komponen DNA meningkatkan tingkat pemanfaatan fragmen yang ada.

Teknik perakitan in vivo

Meskipun in vitro fragmen yang dirakit dapat mencapai ukuran ratusan kb, hasilnya sering kali tidak cukup, sehingga memerlukan amplifikasi menggunakan organisme seperti Escherichia coli. Dalam menyusun fragmen yang melebihi 20 kb, sistem rekombinan di dalam organisme sering kali digunakan, termasuk Bacillus subtilis, ragi, dan bakteri yang dimodifikasi. Ragi, sebagai inang yang umum digunakan, telah dikenal karena kemampuan rekombinasi homologus yang efisien selama bertahun-tahun. Ini dapat digunakan untuk menyusun kromosom buatan hingga beberapa megabase (Mb) dalam panjang. Selain itu, Saccharomyces cerevisiae menunjukkan toleransi luar biasa terhadap panjang kromosom, memberikan dasar teoritis untuk menggunakan ragi dalam membangun kromosom ultra-panjang pada organisme yang lebih tinggi.

Aplikasi

Yaohai Bio-Pharma secara utama menggunakan dua metode perakitan untuk sintesis gen: perakitan ligase dan perakitan DNA polimerase. Metode perakitan ligase menghubungkan fragmen oligonukleotida 5'-fosforilasi yang tumpang tindih dan hibridisasi menjadi DNA dua rantai menggunakan ligase DNA. Metode perakitan polimerase memanfaatkan polimerase DNA untuk memperpanjang fragmen oligonukleotida yang tumpang tindih melalui hibridisasi, mendapatkan campuran dengan panjang berbeda, dan akhirnya memperbanyak fragmen penuh yang berhasil dirakit menggunakan primer. Yaohai dapat membantu klien memenuhi persyaratan tertentu dalam sintesis gen.

Kami juga secara aktif mencari mitra global, baik lembaga maupun individu. Kami menawarkan kompensasi paling kompetitif di industri. Jika Anda memiliki pertanyaan, silakan hubungi kami: [email protected]