mRNA 3' পলি(A) চরিত্রায়ন
mRNA 3' পলি(A) চরিত্রায়ন
mRNA এর 3' পলি(A) টেইল (পলিয়াডেনোসাইনস) পোস্ট-ট্রান্সক্রিপশনাল রেগুলেশনের অবিচ্ছেদ্য অংশ, যা mRNA রপ্তানি, স্থিতিশীলতা এবং অনুবাদকে প্রভাবিত করে। ইন ভিট্রো-ট্রান্সক্রাইবড (আইভিটি) এমআরএনএ-এর ক্ষেত্রে, পলি(এ) টেলটি টেমপ্লেটেড পদ্ধতিতে সহ-প্রতিলিপির সময় বা নন-টেমপ্লেটেড পদ্ধতিতে একটি এনজাইমেটিক টেলিং প্রক্রিয়ার মাধ্যমে প্রবর্তন করা হয়। এই 3′ পলি(A) IVT RNA-এর জন্য একটি ক্রিটিকাল কোয়ালিটি অ্যাট্রিবিউট (CQA) হিসেবে কাজ করে, প্রক্রিয়ার বিকাশ এবং ব্যাচ রিলিজ উভয়ের সময়ই পুঙ্খানুপুঙ্খ চরিত্রায়নের প্রয়োজন হয়।
ইয়াওহাই বায়ো-ফার্মা বিশেষায়িত 3' পলি(A) চরিত্রায়ন পরিষেবা প্রদান করে, কৌশল ব্যবহার করে যেমন রাইবোনুক্লিজ T1 (RNase T1) ক্লিভেজ, আয়ন-পেয়ার রিভার্সড-ফেজ হাই পারফরম্যান্স লিকুইড ক্রোমাটোগ্রাফি (IP-RP-HPLC)/তরল ক্রোমাটোগ্রাফি-মাস স্পেকট্রোমেট্রি (এলসি-এমএস), এবং ব্যাপক তথ্য বিশ্লেষণ।
mRNA 3' পলি(A) চরিত্রায়নের জন্য নিয়ন্ত্রক প্রয়োজনীয়তা
WHO এর নিয়ন্ত্রক বিবেচনা অনুযায়ী, "mRNA এর কাঠামোর অখণ্ডতাকে mRNA প্রকাশের জন্য একটি গুরুত্বপূর্ণ মানের বৈশিষ্ট্য হিসাবে বিবেচনা করা হয়। সুতরাং, mRNA অখণ্ডতা, 5′ ক্যাপিং দক্ষতা, 3′ পলি(A) লেজের উপস্থিতি বা দৈর্ঘ্য ইত্যাদির জন্য নিয়ন্ত্রণ প্রয়োজন।"
বিশ্লেষণী পদ্ধতি
বিশ্লেষণ | পদ্ধতি |
mRNA 3' পলি(A) চরিত্রায়ন | Lহজমের পর সি-এমএস |
কার্যপ্রণালী
ধাপ 1. RNase T1 ক্লিভেজ
LC-MS দ্বারা পূর্ণ-দৈর্ঘ্যের অক্ষত mRNA এর সরাসরি বিশ্লেষণ এর আকার এবং ভিন্নতার কারণে অব্যবহারিক। পলি(A) লেজটি পরীক্ষা করার জন্য, এটিকে পূর্ণ-দৈর্ঘ্যের mRNA থেকে ক্লিভ করতে হবে। প্রচলিত পদ্ধতিতে RNase T1 এর সাথে এনজাইমেটিক হজম হয়, পলি(A) সিকোয়েন্স সংরক্ষণ করার সময় বেছে বেছে rG-এর 3′ প্রান্তটি ক্লিভ করা হয়। mRNA নমুনা RNase T1 দিয়ে হজম হয় এবং পলি(A) প্রসারিত ক্লিভেজ টুকরো অলিগো ডিটি-কোটেড ম্যাগনেটিক বিড ব্যবহার করে বিচ্ছিন্ন করা হয়।
ধাপ 2. IP-RP-HPLC/LC-MS
নিষ্কাশিত লেজগুলি LC-MS ব্যবহার করে বিশ্লেষণ করে, একক-নিউক্লিওটাইড রেজোলিউশনে সুনির্দিষ্ট লেজের দৈর্ঘ্যের তথ্য সরবরাহ করে। অলিগোনিউক্লিওটাইড এলসি-এমএস বিশ্লেষণে, অ্যামাইন মোবাইল ফেজ অ্যাডিটিভের সাথে আয়ন-পেয়ারিং রিভার্সড-ফেজ (আইপি-আরপি) বিচ্ছেদ পছন্দের ক্রোমাটোগ্রাফিক মোড হিসাবে দাঁড়িয়েছে, তাদের শক্তিশালী সমাধান করার ক্ষমতা এবং ভর স্পেকট্রোমেট্রি (এমএস) এর সাথে সামঞ্জস্যের কারণে।
ধাপ 3. ডেটা বিশ্লেষণ
পলি(A) লেজের দৈর্ঘ্য এবং এর আপেক্ষিক প্রাচুর্য এডিনোসিনের ভর দ্বারা ভাগ করা শিখরের সংখ্যা এবং তীব্রতার উপর নির্ভর করে। ভর বর্ণালী প্রক্রিয়াকরণ বা ডিকনভোলুট করার পরে, একটি 100-মের পলি(A) লেজের প্রত্যাশিত ভর (বাক্সে 33,163 Da) সনাক্ত করা হয়, যার সাথে 329 amu ব্যবধানে ভরের একটি সিরিজ রয়েছে, যা অ্যাডেনোসিন (A) ভরের সমতুল্য। .
LC-MS সহ 3' পলি(A) ক্যারেক্টারাইজেশনের কেস
ইয়াওহাই-বায়োফার্মা mRNA 3' পলি(A) চরিত্রায়নের জন্য একটি শক্তিশালী পদ্ধতি তৈরি করেছে, যার মধ্যে রয়েছে RNase T1 ক্লিভেজ এবং IP-RP-HPLC/LC-MS।
ইয়াওহাই-বায়োফার্মা mRNA 3' পলি(A) চরিত্রায়নের জন্য একটি শক্তিশালী পদ্ধতি তৈরি করেছে, যার মধ্যে রয়েছে RNase T1 ক্লিভেজ এবং IP-RP-HPLC/LC-MS।
EN
