Характарыстыка мРНК 3' полі(А).
Характарыстыка мРНК 3' полі(А).
3' полі(А) хвост (полиаденозины) мРНК з'яўляецца неад'емнай часткай посттранскрипционной рэгуляцыі, уплываючы на экспарт мРНК, стабільнасць і трансляцыю. У выпадку транскрыбаваных in vitro (IVT) мРНК полі(А)-хвост уводзіцца альбо падчас сумеснай транскрыпцыі шаблонным спосабам, альбо праз ферментатыўны хваставы працэс без шаблону. Гэты 3' полі(А) служыць крытычным атрыбутам якасці (CQA) для IVT РНК, што патрабуе дбайнай характарыстыкі як падчас распрацоўкі працэсу, так і падчас выпуску партыі.
Yaohai Bio-Pharma прадастаўляе спецыялізаваныя паслугі па характарызацыі 3'-полі(А) з выкарыстаннем такіх метадаў, як расшчапленне рыбануклеазай Т1 (РНКаза Т1), высокаэфектыўная вадкасная храматаграфія са зваротнай фазай іённых пар (IP-RP-HPLC)/вадкасная храматаграфія-мас-спектраметрыя (LC-MS), і комплексны аналіз дадзеных.
Нарматыўныя патрабаванні да характарыстыкі мРНК 3' полі(А).
Згодна з нарматыўнымі меркаваннямі СААЗ, «цэласнасць структуры мРНК лічыцца найважнейшым атрыбутам якасці для вызвалення мРНК. Такім чынам, неабходна кантраляваць цэласнасць мРНК, эфектыўнасць закрывання 5', наяўнасць або даўжыню хваста 3' полі(А) і гэтак далей».
Аналітычны метад
Аналіз |
Методыка |
Характарыстыка мРНК 3' poly(A). |
LC-MS пасля стрававання |
Працэдура
Крок 1. Расшчапленне РНКазой Т1
Прамы аналіз поўнаразмернай інтактнай мРНК з дапамогай ВХ-МС немэтазгодны з-за яе памеру і гетэрагеннасці. Каб даследаваць полі(А) хвост, яго трэба адшчапіць ад мРНК поўнай даўжыні. Распаўсюджаны метад уключае ферментатыўнае расшчапленне з дапамогай РНКазы Т1, селектыўнае расшчапленне 3'-канца rG пры захаванні паслядоўнасці полі(А). Узор мРНК падвяргаецца расшчапленню з дапамогай РНКазы T1, і фрагменты расшчаплення, якія змяшчаюць участкі полі(А), вылучаюць з дапамогай магнітных шарыкаў, пакрытых аліга-dT.
Крок 2. IP-RP-HPLC/LC-MS
Выдзеленыя хвасты былі прааналізаваны з дапамогай ВХ-МС, што дало дакладную інфармацыю аб даўжыні хваста з дазволам аднаго нуклеатыду. У алігануклеатыдным ВХ-МС-аналізе пераважным храматаграфічным рэжымам з'яўляецца раздзяленне са зваротнай фазай іённага спарвання (IP-RP) з дадаткамі рухомай фазы амінаў дзякуючы іх высокай раздзяляльнай здольнасці і сумяшчальнасці з мас-спектраметрыяй (МС).
Крок 3. Аналіз дадзеных
Даўжыня полі(А) хваста і яго адносная колькасць залежаць ад колькасці і інтэнсіўнасці пікаў, падзеленых на масу адэназіну. Пасля апрацоўкі або дэканвалюцыі спектру мас выяўляецца меркаваная маса 100-мернага хваста полі(А) (33,163 329 Да ў скрынцы), якая суправаджаецца серыяй мас, разнесеных на XNUMX а.е.м., што эквівалентна масе адэназіну (А) .
Выпадак 3' полі(А) Характарыстыка з ВХ-МС
Yaohai-BioPharma распрацавала надзейны метад для характарыстыкі мРНК 3' poly(A), уключаючы расшчапленне РНКазой T1 і IP-RP-HPLC/LC-MS.
Yaohai-BioPharma распрацавала надзейны метад для характарыстыкі мРНК 3' poly(A), уключаючы расшчапленне РНКазой T1 і IP-RP-HPLC/LC-MS.
EN
