мРНК 5'capping Эфектыўнасць
Значэнне аналізу эфектыўнасці кэпінгу мРНК 5'
Кэп-структура, размешчаная на 5'-канцы мРНК, адыгрывае ключавую ролю ў эфектыўнай трансляцыі, стабілізацыі і транспарціроўцы мРНК у эукарыёт. У кантэксце мРНК, транскрыбаванай in vitro (IVT), 5'-кэп уводзіцца праз працэсы сумеснага транскрыпцыйнага кэпавання або ферментатыўнага кэпавання. З'яўляючыся незаменным кампанентам IVT РНК, 5' каўпачок з'яўляецца найважнейшым атрыбутам якасці (CQA), які патрабуе комплекснай характарыстыкі на працягу распрацоўкі працэсу і выпуску партыі.
Yaohai-Bio Pharma прадастаўляе комплексныя рашэнні для аналізу эфектыўнасці 5'-закрыцця, якія ахопліваюць канструкцыю алігануклеатыдных лубкоў (зонда), расшчапленне РНКазы H, высокапрадукцыйную вадкасную храматаграфію са зваротна-фазавай парай іёнаў IP-RP (IP-RP-HPLC)/вадкасную храматаграфію -мас-спектраметрыя (LC-MS), аналіз дадзеных.
Нарматыўныя патрабаванні да цэласнасці мРНК
Згодна з нарматыўнымі меркаваннямі СААЗ, «цэласнасць структуры мРНК лічыцца найважнейшым атрыбутам якасці для вызвалення мРНК. Такім чынам, неабходна кантраляваць цэласнасць мРНК, эфектыўнасць закрывання 5', наяўнасць або даўжыню хваста 3' полі(А) і гэтак далей».
Аналітычны метад
Аналіз |
Методыка |
мРНК 5'capping Эфектыўнасць |
LC-MS пасля стрававання |
Працэдура
Этап 1. Дызайн алігануклеатыдных лубкоў (зонда).
Зонд расшчаплення, які ўключае 2'-O-метилнуклеотиды і тетрадезоксирибонуклеотиды, служыць для расшчаплення камплементарнай ланцуга РНК у пэўных месцах, калі прысутнічае РНКаза Н. Гэты метад аказваецца вельмі каштоўным для мэтавай генерацыі вялікіх фрагментаў РНК.
Этап 2. Расшчапленне РНКазой Н
Біятыніляваны зонд, стратэгічна распрацаваны, каб быць камплементарным 5'-канцу мРНК, прымяняецца ў спалучэнні з РНКазай Н для каталізацыі мэтанакіраванага расшчаплення 5'-канцавога алігануклеатыду, які валодае структурай каўпачка.
Крок 3. IP-RP-HPLC/LC-MS
У аналізе алігануклеатыдаў LC-MS пераважным храматаграфічным рэжымам з'яўляецца раздзяленне са зваротнай фазай іённых пар (IP-RP) з выкарыстаннем дадаткаў рухомай фазы амінаў. Гэта тлумачыцца іх найвышэйшай раздзяляльнай здольнасцю і сумяшчальнасцю з мас-спектраметрыяй (МС).
Крок 4. Аналіз дадзеных
Выразныя масы, якія назіраюцца ў фрагментах расшчаплення з каўпачком m7GpppG, у адрозненне ад тых, што маюць дыфасфатны, трыфасфатны або неметыляваны каўпачок G (GpppG), палягчаюць іх ідэнтыфікацыю і дазваляюць ацаніць эфектыўнасць каўпачка.
Выпадак аналізу эфектыўнасці ўкупоркі з ВХ-МС
Кампанія Yaohai-Bio Pharma распрацавала надзейныя метады для аналізу эфектыўнасці капіравання мРНК, пачынаючы ад распрацоўкі алігануклеатыдных лубкоў (зонда), расшчаплення РНКазай H, IP-RP-HPLC/LC-MS і заканчваючы аналізам даных.
Сумарныя іонныя храматаграмы (злева) і мас-спектры электрараспылення (справа) фрагментаў расшчаплення 5'-канца
EN
