mRNA 3' poli(A) Karakterisering
mRNA 3' poli(A) Karakterisering
Die 3' poli(A) stert (poliadenosiene) van mRNA is 'n integrale deel van post-transkripsionele regulering, wat mRNA uitvoer, stabiliteit en translasie beïnvloed. In die geval van in vitro-getranskribeerde (IVT) mRNA's, word die poli(A)-stert ingebring óf tydens ko-transkripsie op 'n templaat wyse of deur 'n ensiematiese stertproses op 'n nie-getempleerde wyse. Hierdie 3′ poli(A) dien as 'n kritieke kwaliteit eienskap (CQA) vir IVT RNAs, wat deeglike karakterisering tydens beide prosesontwikkeling en bondelvrystelling noodsaak.
Yaohai Bio-Pharma verskaf gespesialiseerde 3'-poli(A)-karakteriseringsdienste, deur gebruik te maak van tegnieke soos ribonuklease T1 (RNase T1) splitsing, ioon-paar omgekeerde-fase hoë werkverrigting vloeistofchromatografie (IP-RP-HPLC)/vloeistofchromatografie-massaspektrometrie (LC-MS), en omvattende data-analise.
Regulatoriese vereistes vir mRNA 3' poli(A) karakterisering
Volgens die WGO se regulatoriese oorwegings, "word die integriteit van die struktuur van die mRNA beskou as 'n kritieke kwaliteit eienskap vir die vrystelling van die mRNA. Beheer is dus nodig vir mRNA-integriteit, 5′-bedekkingsdoeltreffendheid, 3′ poli(A) stert teenwoordigheid of lengte en so aan.”
Analitiese metode
Analise |
Metodes |
mRNA 3' poli(A) karakterisering |
LC-MS na vertering |
Prosedure
Stap 1. RNase T1 splitsing
Direkte ontleding van vol-lengte ongeskonde mRNA deur LC-MS is onprakties as gevolg van sy grootte en heterogeniteit. Om die poli(A)-stert te ondersoek, moet dit van die vollengte-mRNA afgesny word. Die algemene metode behels ensiematiese vertering met RNase T1, wat die 3'-kant van rG selektief splits terwyl die poli(A)-volgorde bewaar word. Die mRNA-monster ondergaan vertering met RNase T1, en splitsingsfragmente wat poli(A)-streke bevat, word geïsoleer met behulp van oligo dT-bedekte magnetiese krale.
Stap 2. IP-RP-HPLC/LC-MS
Die onttrekte sterte het analise ondergaan deur gebruik te maak van LC-MS, wat presiese stertlengte-inligting by enkel-nukleotied resolusie bied. In oligonukleotied LC-MS-analise, is ioon-parende omgekeerde fase (IP-RP) skeidings met amien mobiele fase bymiddels die voorkeur chromatografiese modus, as gevolg van hul robuuste oplossvermoë en verenigbaarheid met massaspektrometrie (MS).
Stap 3. Data-analise
Die poli(A) stertlengte en sy relatiewe oorvloed hang af van die aantal en intensiteit van pieke gedeel deur 'n massa adenosien. By die verwerking of ontwikkeling van die massaspektrum word die verwagte massa van 'n 100-meer poli(A) stert (33,163 329 Da in boks) onderskei, vergesel van 'n reeks massas gespasieer met XNUMX amu, gelykstaande aan die massa adenosien (A) .
Geval van 3' poli(A) Karakterisering met LC–MS
Yaohai-BioPharma het 'n robuuste metode ontwikkel vir mRNA 3' poli(A) karakterisering, insluitend RNase T1-splyting en IP-RP-HPLC/LC-MS.
Yaohai-BioPharma het 'n robuuste metode ontwikkel vir mRNA 3' poli(A) karakterisering, insluitend RNase T1-splyting en IP-RP-HPLC/LC-MS.
EN
