mRNA 5'capping Doeltreffendheid
Die betekenis van mRNA 5'capping Doeltreffendheidsanalise
Die kapstruktuur wat aan die 5'-punt van mRNA geleë is, speel 'n deurslaggewende rol in die doeltreffende translasie, stabilisering en vervoer van mRNA's binne eukariote. In die konteks van in vitro-getranskribeerde (IVT) mRNA, word die 5'-kap ingebring deur óf ko-transkripsionele kapping óf ensiematiese kappingsprosesse. As 'n onontbeerlike komponent van IVT RNA's, staan die 5' cap as 'n kritieke kwaliteit eienskap (CQA) wat omvattende karakterisering deur prosesontwikkeling en bondelvrystelling noodsaak.
Yaohai-Bio Pharma bied omvattende 5'-bedekking doeltreffendheid analise oplossings, wat oligonukleotied spalke (sonde) ontwerp, RNase H splitsing, IP-RP-ioon-paar omgekeerde-fase hoë-prestasie vloeistofchromatografie (IP-RP-HPLC)/vloeistofchromatografie insluit -massaspektrometrie (LC-MS), data-analise.
Regulatoriese vereistes vir mRNA-integriteit
Volgens die WGO se regulatoriese oorwegings, "word die integriteit van die struktuur van die mRNA beskou as 'n kritieke kwaliteit eienskap vir die vrystelling van die mRNA. Beheer is dus nodig vir mRNA-integriteit, 5′-bedekkingsdoeltreffendheid, 3′ poli(A) stert teenwoordigheid of lengte en so aan.”
Analitiese metode
Analise |
Metodes |
mRNA 5'capping Doeltreffendheid |
LC-MS na vertering |
Prosedure
Stap 1. Oligonukleotied spalke (sonde) ontwerp
Die splitsingsonde, wat 2'-O-metielnukleotiede en tetradeoksiribonukleotiede inkorporeer, dien om 'n komplementêre RNA-string op spesifieke posisies te splits wanneer RNase H teenwoordig is. Hierdie metode bewys hoogs waardevol vir die geteikende generering van groter RNA-fragmente.
Stap 2. RNase H splitsing
'n Gebiotinileerde sonde, strategies ontwerp om aanvullend tot die 5'-kant van mRNA te wees, word saam met RNase H toegepas om die geteikende splitsing van die 5'-einde oligonukleotied wat 'n kapstruktuur het, te kataliseer.
Stap 3. IP-RP-HPLC/LC-MS
In oligonukleotied LC-MS analise is die voorkeur chromatografiese modus ioonparende omgekeerde fase (IP-RP) skeidings deur gebruik te maak van amien mobiele fase bymiddels. Dit word toegeskryf aan hul voortreflike oplosvermoë en verenigbaarheid met massaspektrometrie (MS).
Stap 4. Data-analise
Afsonderlike massas waargeneem in splitsingsfragmente wat 'n m7GpppG-dop bevat, in teenstelling met dié met 'n difosfaat-, trifosfaat- of ongemetileerde G-dop (GpppG), vergemaklik hul identifikasie en maak die skatting van kapdoeltreffendheid moontlik.
Geval van kapdoeltreffendheidontleding met LC–MS
Yaohai-Bio Pharma het robuuste metodes ontwikkel vir mRNA-beperkingsdoeltreffendheidsanalise, van oligonukleotied spalke (probe) ontwerp, RNase H splitsing, IP-RP-HPLC/LC-MS tot data-analise.
Die totale ioonchromatogramme (links) en elektrosproei-massaspektra (regs) van 5'-end-splitsingsfragmente
EN
