Odkrivanje skrivnosti ekstrakcije visokokakovostnega plazmida Slovenija

Ekstrakcija plazmidov je ključnega pomena za raziskovalce. Plazmidi so kot genski vektorji ključnega pomena pri raziskavah cepiv in genski terapiji, kjer je kakovost pomembna. Ključni dejavniki kakovosti vključujejo superzvit delež in vsebnost endotoksina. Predpisi se razlikujejo: FDA ≥80 %, SMPA ≥85 %, NMPA ≥90 %, z <5 % linearne/odprte krožne DNK. Stranke imajo pogosto raje ≥95 % supercoiled. Ravni endotoksina so: raziskave (>50 EU/µg), transfekcija (<50 EU/µg) in brez endotoksina (<0.1 EU/µg).

Superzvita plazmidna DNA

Plazmidi iz Escherichie coli vključujejo superzvito (SC), odprto krožno (OC) in linearno (L) DNA. Visok delež SC poveča učinkovitost in izražanje transfekcije. Na primer, transfekcija plazmida SC s 85.45 % je 2.5-krat višja, ekspresija HGF plazmida s 93.28 % SC pa je 1.8-krat višja, kar potrjuje superiornost SC DNA.

Odprta krožna DNK: Ko se ena veriga dvoverižne DNK zlomi, superzvita struktura postane ohlapna in tvori odprtokrožni plazmid z večjim volumnom, ki se med elektroforezo najpočasneje premika in je nameščen na vrhu.

Linearna DNA: Ko se obe verigi plazmidne DNA zlomita, nastane linearna struktura z relativno manjšim volumnom, ki migrira hitreje kot odprtokrožna DNA, vendar počasneje kot superzvita DNA, ki je na drugem mestu.

Superzvita DNK: Dve vijačnici se prepletata, zvijata v superzvito strukturo, ki temelji na vijačnici DNK. Ima najmanjši volumen in najhitreje migrira med elektroforezo, nameščen na dnu.

Kvantitativna analiza superzvitega razmerja

Laboratoriji uporabljajo elektroforezo v agaroznem gelu (AGE) in Gel-Pro Analyzer za presojo deleža superzvitja prek slik elektroforeze. Ena slika prikazuje 97.539 % SC DNK, druga pa 63.833 % SC in 36.167 % OC DNK (linearna DNK ni vidna).

Skrivnost endotoksina v plazmidih

Endotoksin je sestavni del zunanje plasti celične stene gramnegativnih bakterij, ki se sprosti po bakterijski smrti ali lizi, vsebuje toksični lipopolisaharid A. Med ekstrakcijo plazmida endotoksin vstopi v raztopino za lizo, kar vpliva na učinkovitost transfekcije in sproži nespecifične imunske odzive, do lažno pozitivnih rezultatov v poskusih.

Kvantitativna in kvalitativna analiza endotoksina

Test Limulus amebocyte lysate (LAL) zazna endotoksin z aglutinacijo z 2-keto-3-deoksioktonsko kislino (KDO) v lipopolisaharidu (LPS). Je kvalitativna in polkvantitativna, kar kaže na prisotnost endotoksina s koagulacijo ali spremembo barve pri mešanju z vzorci.

Yaohai Bio-Pharma ponuja superzvite plazmide brez endotoksinov. Zunanje izvajanje Yaohaiju poveča učinkovitost transfekcije in izražanja. Dostavljeni plazmidi imajo ≥95 % SC delež (povprečno 85 %±10 %) in ravni endotoksina ≤0.1, ≤0.01 ali ≤0.005 EU/μg.

Aktivno iščemo tudi institucionalne ali individualne globalne partnerje. Ponujamo najbolj konkurenčno nadomestilo v panogi. Če imate kakršna koli vprašanja, nas kontaktirajte: [email protected]